作者无任何利益冲突需要披露。

皮层神经发生：从实验室进展到细胞治疗的转化

Cortical Neurogenesis: Transitioning from Advances in the Laboratory to Cell-Based Therapies

我叫 Arnold Krickstein。我是加州大学旧金山分校再生医学研究所的所长，我的研究领域是发育神经生物学。具体而言，我们非常关注大脑皮层发育的早期阶段，一直在研究神经干细胞和前体细胞，探索它们如何产生神经元，以及这些神经元如何迁移并在发育中的大脑（尤其是皮层）中开始形成神经环路。在子宫内电穿孔技术的出现，我认为是SDO及其同事引入的一项具有变革性的技术，对于研究大脑发育的早期阶段具有重要意义，因为它使我们能够针对多种基因开展基因功能获得和功能缺失实验。该技术操作相对简单，只需将目标基因直接导入在早期皮层发育过程中生成神经元的神经干细胞和前体细胞中即可。该技术的核心步骤是：在胚胎期动物的脑室中注射质粒形式的DNA，然后施加短暂的电脉冲，使这些质粒进入脑室壁上的细胞，这些细胞即放射状胶质神经上皮细胞，它们随后会生成神经元，并最终产生胶质细胞。这包括使用短干扰RNA来下调或敲低特定基因的表达，或者直接过表达特定的基因产物。这两类实验均可观察对发育中大脑的互补效应。靶向分子几乎可以涵盖参与大脑发育早期阶段的任何分子，甚至包括突触发育或成熟阶段的相关分子。该技术的出现已经对发育中大脑的研究产生了重大影响，并有望在不久的将来产生更大的影响。衬在脑室壁上并最终生成大脑中所有神经元和胶质细胞的细胞，最初为神经上皮细胞。但在神经元开始发育的时期，这些细胞会转变为或开始转化为一种称为放射状胶质细胞的胶质细胞。它们与血管形成特化的连接，并引导新生神经元的迁移。在此期间，它们开始进行一系列有趣的、不同类型的分裂。它们会进行一种对称性的前体细胞分裂，每次分裂产生两个放射状胶质细胞，从而增加自身的数量。它们还会进行不对称的成神经分裂，即在每次细胞周期中分裂并自我更新，同时产生一个分化为神经元的子代细胞。但研究还发现，它们会进行一种非常有趣的第三种类型的分裂，这种分裂属于不对称分裂，其两个子代细胞彼此不同：其中一个为自我更新的放射状胶质细胞，另一个则转变为另一种类型的前体细胞。我们将这种细胞称为中间前体细胞，它会从脑室迁移出去，随后通常在另一个增殖区域——即脑室下区——进行分裂。子宫内电穿孔技术是一种便捷的方法，可在放射状胶质细胞进行不同类型分裂的阶段，将这些基因敲低或过表达的DNA导入其中。我们还使用了一种表达绿色荧光蛋白的逆转录病毒作为谱系标记物，通过将这种病毒标记物注射到相同发育阶段胚胎的脑室内，便可以追踪单个标记细胞在分裂并产生子代细胞克隆过程中的命运变化。随着时间推移，我们通过对脑片培养物进行延时成像，可以追踪这些细胞迁移至大脑皮层后的最终命运。尽管长期以来人们认为脑室区是发育中大脑神经发生的主要来源，但至少在胚胎期，脑室下区作为大量神经发生来源的重要性正日益受到重视。我们的研究发现，在脑室下区，中间前体细胞本身起源于脑室区的放射状胶质细胞，它们迁移至此，并以对称方式分裂：要么产生更多自我更新的中间前体细胞，要么通过对称的终末分裂产生成对的神经元，随后这些神经元迁移至大脑皮层。因此，室下区在胚胎期或发育中的大脑中正被证明是神经发生的一个非常重要的、引人关注的区域。此外，这些中间前体细胞在位于室下区时会转变为多极细胞，并似乎具备在该区域内进行切向迁移的能力。这或许可以解释先前研究中观察到的细胞克隆扩散现象，例如，Walsh 和 S Cepco 早前在发育中的大脑皮层中利用逆转录病毒标记细胞命运时所发现的结果。例如，实际上有多个有趣的基因参与了神经发生或神经元迁移过程。在我们的实验室中，我们研究了间隙连接蛋白，即形成众所周知的间隙连接通道的连接结构。但有趣的是，我们发现沿着放射状胶质细胞（radial glia）迁移的细胞实际上并非将这些间隙连接用作通信通道，而是将其作为黏附分子，使神经元和迁移中的细胞能够物理性地黏附于放射状纤维上。这些研究实际上是使用siRNA来降低特定连接蛋白的表达而完成的。例如，连接蛋白43（connection 43）在放射状胶质细胞（radio ggl）及其子代神经元和中间前体细胞中均高度表达。许多所谓的成体干细胞实际上可能来源于胎儿大脑的放射状胶质细胞，在体外培养中，当使用诸如bFGF等适当的生长因子处理时，这些细胞能够被扩增。但除了这些放射状胶质细胞（radial glia）之外，中间前体细胞可能成为干细胞研究中一个非常有趣的目标，因为我们相信它们实际上会产生类型非常特异的神经元。因此，如果某种策略旨在大量生成特定类型的神经元，那么识别并分离出负责产生该特定神经元类型的中间前体细胞，可能是一种远优于例如大量扩增放射状胶质细胞的方法——因为后者可能会产生多种不同类型的细胞。事实上，在已开展的体外研究中发现，当扩增胚胎干细胞系并从中诱导生成单个神经元时，这些细胞系中的大多数似乎都会经历一个甚至可能是必需的、类似上皮细胞或放射状胶质细胞的阶段，然后才能真正生成神经元。例如，Austin Smith 用于生成神经元或神经干细胞的实验方案实际上与放射状胶质细胞非常相似。这些细胞会经历动力核迁移，表达放射状胶质细胞的转录因子和标志物，并以与放射状胶质细胞非常相似的方式产生神经元和星形胶质细胞。同样，Loren Ser 及其他研究人员利用人类胚胎干细胞进行研究，发现这些细胞会形成玫瑰花结样结构，在体外分化为神经元之前，会自发组装成一种类似神经上皮的结构。而这些玫瑰花结结构由一些形态上与放射状胶质细胞非常相似的细胞组成。因此，这些放射状胶质细胞可能是一类神经干细胞的观点，我认为得到了这类体外实验证据的支持。因此，在神经发生开始之前，整个脑室系统的室管膜区以及实际上整个脊髓中，已经存在区域性的模式化。在特定区域表达的这些模式化基因，可能已经限制了在该区域产生的子代细胞的命运。例如，如果你想生成兴奋性脑膜旁细胞，可利用背侧皮层放射状胶质细胞来产生这类细胞；而如果你想生成中间神经元，则可能需要使用神经节隆起中的细胞，因为这些细胞能够产生中间神经元或少突胶质细胞等。因此，如果你在干细胞研究中的策略——就疾病治疗而言——涉及大量生成某种特定类型的细胞，例如某种中间神经元或某种兴奋性投射细胞，那么目前正逐步揭示不同脑区之间神经发生差异的发育学研究，很可能会提供一些线索，这些线索最终可用于设计特定细胞类型神经元的扩增策略，用于细胞替代疗法。再生或再生医学这一术语，实际上暗示了器官再生的能力。我认为，大多数公众将干细胞视为一种用于替换受损细胞和组织的方法。但实际上，我认为干细胞研究最早可能带来的治疗应用将涉及以其他方式——或许更具创造性地——使用干细胞。例如，在实验室中利用干细胞研究，通过高通量方法筛选药物，使用人类细胞而非小鼠细胞来模拟疾病模型。而在细胞治疗方面，我认为其应用将主要体现为一种递送载体，事实上，这种应用已经初步开始。例如，利用某些干细胞向损伤或病变区域迁移的能力，将特定的“载荷”——如基因、基因产物或缺失的酶等——递送至目标部位。我认为，不涉及细胞整合到已有器官结构中的应用是更容易实现的目标。一些早期的细胞治疗实例可能将采用这种方法，而非真正的细胞替代。目前，联邦政府对国立卫生研究院（NIH）资金仅能用于少数几种人胚胎干细胞研究的限制，实际上对该领域的发展产生了严重的抑制作用。这些限制使一些年轻的研究人员无法进入这一领域，也阻止了其他研究人员在实验室中探索胚胎干细胞潜在用途的可能性。人们曾试图放宽这些限制。正如大多数观众可能知道的那样，总统已经否决了一项法案，而且，抱歉，他即将否决另一项法案。我们希望这些政策能够改变，从而有可能使用美国国立卫生研究院（NIH）的资金来研究一系列新开发的干细胞系，其中许多干细胞系相较于2001年之前建立的原始细胞系具有优势。但即使对该类研究的资助禁令被解除，也未必会立即导致此类研究经费的增加。此外，由于国会提出的这项法案并非一项拨款或预算法案，其影响将主要体现在使我们这样的研究人员能够在同一研究环境、同一实验室中，使用相同设备或共享部分相同资源，更便利地将所谓“获批”与“未获批”细胞系的研究工作结合起来。尽管如此，这将是一个巨大的进步，但不太可能为这类活动带来大量实际支持，即研究经费。对此，我认为我们仍需依赖私人资金来源，包括州政府资助。例如，在加利福尼亚州，这种资助对干细胞领域的研究人员而言是一大利好。此外，纽约州、康涅狄格州和马萨诸塞州等其他州也纷纷效仿，即将启动各自针对干细胞研究的州级资助计划。我认为这将在可预见的未来成为推动该领域研究的重要动力，无论美国国立卫生研究院（NIH）的政策是否很快发生变化。

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