基于微流控图案化与荧光标记的单细胞细菌生长追踪

摘要

来源：Pioli, R., et al., 通过连续毛细辅助组装实现微生物与微粒的图案化。 J. Vis. Exp. (2021)

本视频演示了使用无碳悬浮液和可控流体，通过微流控捕获装置捕获单个荧光标记的大肠杆菌（Escherichia coli）细胞的方法，随后添加营养物质以诱导其生长，并对形成的微菌落进行荧光成像。

方案

1. 细菌图案化

1. 实验前一天，培养一株大肠杆菌（Escherichia coli，菌株MG1655 prpsM-GFP）。直接从冻存菌种接种，在37 °C摇床培养箱中用溶菌肉汤（LB）培养基过夜培养20小时。添加50 µg/mL卡那霉素，以确保细胞保留prpsM-GFP（绿色荧光蛋白）质粒。
2. 实验当天，在实验开始前数小时将箱式培养箱（图1A）设定为37 °C，以确保温度均匀且稳定。随后，在显微镜载物台上安装注射泵和加热玻璃板（图1B,C），并将温度设定为与箱式培养箱相同的温度。
   注意：将整个系统（包括显微镜（图1E））封闭在箱式培养箱内，可确保在用培养基冲洗通道时，整个实验过程中维持均匀且恒定的温度。
3. 实验前90分钟，将微流控芯片置于盛有100%乙醇（EtOH）的容器中，并用100% EtOH冲洗通道至少10分钟。将微流控芯片放入真空干燥器中，抽真空脱气至少30分钟。用蒸馏水替换乙醇，并对芯片进行真空处理至少30分钟。将微流控芯片放入70 °C烘箱中加热10分钟，以去除通道中残留的任何液体。
   注意：此步骤对于防止用培养基冲洗时通道内产生气泡至关重要。
4. 用移液器将1 mL 3-（N-吗啉代）丙磺酸（MOPS）培养基（1x）加入离心管中，并加入10 µL 0.132 M磷酸钾（K₂HPO₄）。从37 °C培养箱中取出过夜培养物，取100 µL加入离心管中，在2,300 × g条件下离心2分钟。小心吸除上清液，将沉淀重悬于1 mL新鲜MOPS培养基中，其中含0.015% v/v Tween 20和0.01% v/v磷酸钾。
   注意：细菌悬液的典型浓度范围为0.015–0.15 vol%，该浓度可确保形成延展且可移动的富集区，并防止颗粒在基底上聚集。用新鲜培养基替换过夜培养基可最大程度降低细菌膜在模板上释放的风险。新鲜培养基中缺乏碳源，可防止细胞在悬液中生长，从而避免模板图案化过程中细胞增殖。悬液中0.015% v/v的Tween 20浓度对于使退缩液体在PDMS模板上的接触角处于30–60°的最佳范围内是必需的。
5. 将细菌悬液吸入1 mL注射器中，并通过微流控管路将注射器连接至芯片。
   1. 为确保注射器与管路连接牢固，将外径为0.6 mm的针头直接插入管路中。为避免残留于入口附近的悬液在通道内扩散，应通过图案化过程中用作出口的孔（图2A-III）冲洗新鲜培养基，而非通过用作入口的孔。
   2. 将注射器安装至注射泵上，并通过通道上游的入口将悬液注入微流控芯片，直至悬液覆盖带有捕获结构的模板区域。注意：在液体注入过程中，空气可通过通道下游末端的出口排出。
   3. 将注射泵设定为以0.07–0.2 µL/min的流速抽出细菌悬液（图2A-I），在此所述几何结构下，该流速对应弯月面退缩速度为80–100 µm/min。
   4. 通过显微镜软件监测图案化过程。
      注意：此处使用10倍放大倍数监测模板上退缩弯月面的移动，使用20倍放大倍数监测单个细菌沉积至微加工捕获结构中的情况。
6. 当细胞已在模板上完成图案化后（图2A-II），提高抽出流速，快速排空微流控通道，并用先前已脱气至少30分钟且预热至30 °C的新鲜LB培养基冲洗通道。
7. 将注射泵设定为2 µL/min的流速，轻柔冲洗通道。待通道充满后，根据具体实验需求提高流速（15 µL/min）。
8. 以所需的放大倍数和时间间隔采集细菌生长图像。

结果

图1：微流控通道中连续毛细辅助组装平台的示意图。（A）恒温箱。恒温箱在微流控通道内部维持均匀且恒定的温度（此处为30 °C）。（B）装有液体悬浮液的注射器。注射器由注射泵（未显示）控制，用于在图案化过程中调控液体的运动。（C）加热玻璃板。加热玻璃板位于微流控通道下方，确保模板整体温度均匀（此处为30 °C），这对于避免气-液界面附近...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
BD 10 mL 注射器（鲁尔锁）	BD	300912	用于将新鲜的溶菌肉汤冲洗入微流控通道
培养箱	Life Imaging Services		用于确保通道内温度均匀且恒定
离心机	Eppendorf	5424R	用于将过夜培养基替换为新鲜的最低限度培养基
离心管	Eppendorf	30120086	1.5 mL
CETONI Base 120	CETONI GmbH		注射泵
H401-T-CONTROLLER	Okolab		加热玻璃板控制器
H601-NIKON-TS2R-GLASS	Okolab		加热玻璃板
胰岛素注射器，U 100，带鲁尔接头	Codan Medical ApS	CODA621640	1 mL 注射器，用于在图案化过程中吸取液体悬浮液
LB 肉汤，Miller 型（Luria-Bertani）	Fisher Scientific	244610	溶菌肉汤，用于冲洗入微流控通道
Masterflex 转移管路	Masterflex	HV-06419-05	内径 0.020''，外径 0.06''
MOPS (10x)	Teknova	M2101	用 milliQ 水稀释十倍后用于替换过夜培养基
Nikon Eclipse Ti2	Nikon Instruments		显微镜
磷酸氢二钾	Sigma Aldrich	P3786	添加至 1x MOPS 中
Tween 20	Sigma Aldrich	P1379	用于确保图案化过程中具有理想的退缩接触角