厌氧条件下检测生物可利用汞的细菌生物传感器实验

摘要

来源：Stenzler, B. R. et. al., 一种用于检测汞和镉的厌氧生物传感器检测方法。J. Vis. Exp. (2018)

本视频展示了利用基因工程改造的细菌生物传感器，在厌氧条件下精确测量汞离子生物可利用部分的方法。通过调节硫酸镁的浓度，该检测方法确保生物传感器仅对游离汞离子产生响应，响应结果通过荧光强度的变化进行指示。

方案

1. 暴露实验

1. 设计板式布局。
   注意：在开始暴露实验之前，务必完成所有移液量的计算并准备好相应的储备液。如何正确设计实验以及应包含哪些对照组，文中已详细说明。此外，若厌氧监测仪显示厌氧舱内存在氧气，则不应启动实验。
2. 根据96孔模板设计板式布局。该布局可支持32种不同处理条件，每种条件进行3次技术重复，最适宜采用4 × 8网格形式来设置小管（见图1）。

注意： 在检测某一变量对汞（Hg）吸收作用时，采用以下方法 汞诱导型生物传感器 每个变量都需要两种处理： 治疗 （生物传感器 + 汞（Hg）+ 变量 + 硝酸盐）及其 处理空白 （生物传感器 + 变量 + 硝酸盐）。在利用生物传感器研究某一变量对细胞生理功能的影响时 组成型生物传感器， 每个变量需要两个处理： 治疗 （生物传感器 + Hg + 可变 + 硝酸盐）以及 治疗 空白 （生物传感器 + 变量 + Hg）。汞可替换为镉（Cd）。在绘制校准曲线时，Hg 或 Cd 将作为变量。 组成型 和 可诱导的 生物传感器无需在同一时间（在同一块板的布局中）进行检测。以下提供了在测试镁浓度梯度（变量）时，板布局及相应4×8网格的模板示例。 表1.

2. 根据检测板布局设置 4 × 8 网格。

1. 将 7 mL 聚四氟乙烯（PTFE）标准小瓶放入托盘中。
注意： PTFE 小瓶在使用前应经过酸洗或热灭菌处理。操作时仅可通过小瓶外壁进行抓取。

2. 向每个小瓶中加入与各处理相对应的暴露培养基体积。
注意：在总体积为 2,000 µL（2 mL）的暴露体系中，所添加的暴露培养基体积计算公式为：暴露培养基 µL = 2,000 µL – 处理（空白） µL。（例如，暴露培养基 µL = 2,000 – 100 µL（生物传感器）– 40 µL（硝酸盐）– 100 µL（Hg）– 100 µL（变量（例如，硫酸镁， MgSO₄））= 1660 µL）。需确保所添加的待测变量体积不超过最终总体积的 5%（100 µL）。

3. 根据板布局，向每个小瓶中加入待测化学变量溶液的相应体积。

4. 向每个小瓶中加入硝酸盐，使最终浓度为 200 µM（40-80 µL）。对于组成型生物传感器处理空白样，省略此步骤。

5. 根据平板布局，向小瓶中加入 Hg（测试变量时为5 nM）或 Cd（测试变量时为300 nM）。对于汞诱导型生物传感器处理空白组，省略此步骤。

1. 使用汞（Hg）时，取 4-8 µM 储备液并充分震荡。将该溶液用 暴露培养基 在 7 mL 聚四氟乙烯（PTFE）小瓶中稀释至 100–250 nM，以配制工作浓度的汞溶液。再从此工作液中向所需小瓶中加入汞。本实验中，建立 0 至 12.5 nM 范围内的汞标准曲线。
注意： 在检测某一变量对汞（Hg）或镉（Cd）生物可利用性的影响时，需确保所有处理组中的 [Hg] 或 [Cd] 浓度保持恒定。添加汞或镉时，务必使用同一支移液枪头，但切勿让枪头接触小瓶中的暴露培养基。

手动以轨道运动方式振荡。
注意： 根据汞或镉在溶液中形态转化所需时间，实验现在可以暂停。若放置超过一小时，需在聚四氟乙烯（PTFE）小瓶上加盖PTFE瓶盖，以防止蒸发或污染。

轻轻吹打Biosensor Stock 以确保均匀。向每支小瓶中加入 100 µL Biosensor Stock 。手动进行轨道振摇。

将酶标仪预热并设置为以下条件进行检测：温度设为37˚C，动力学检测持续10小时，每2.5-5分钟读数一次，读数之间进行轨道振荡，荧光检测的激发波长为440 nm，发射波长为500 nm。

从4×8网格中的每个PTFE小瓶中用移液器吸取200 µL，加入96孔板（黑色，96孔透明底无结合表面微孔板）的对应孔中。每次转移200 µL前，反复吹打五次。注意：不要丢弃移液器吸头，将吸头保留在PTFE小瓶中，以便跟踪移液操作的进度。

将96孔板放入酶标仪的板架中，然后盖上96孔板的盖子，开始检测。

表1：使用生物传感器在镁浓度梯度（0–10 mM）下检测汞生物可利用性（5 nM）的示例微孔板布局

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

a

Hg诱导型生物传感器 + Hg + 硝酸盐 + 0 mM Mg

Hg诱导型生物传感器 + 硝酸盐 + 0 mM Mg

组成型生物传感器 + Hg + 硝酸盐 + 0 mM Mg

组成型生物传感器 + Hg + 0 mM Mg

b

Hg诱导型生物传感器 + Hg + 硝酸盐 + 0.1 mM Mg

Hg诱导型生物传感器 + 硝酸盐 + 0.1 mM Mg

组成型生物传感器 + Hg + 硝酸盐 + 0.1 mM Mg

组成型生物传感器 + Hg + 0.1 mM Mg

c

Hg诱导型生物传感器 + Hg + 硝酸盐 + 1 mM Mg

Hg诱导型生物传感器 + 硝酸盐 + 1 mM Mg

组成型生物传感器 + Hg + 硝酸盐 + 1 mM Mg

组成型生物传感器 + Hg + 1 mM Mg

d

Hg诱导型生物传感器 + Hg + 硝酸盐 + 10 mM Mg

Hg诱导型生物传感器 + 硝酸盐 + 10 mM Mg

组成型生物传感器 + Hg + 硝酸盐 + 10 mM Mg

组成型生物传感器 + Hg + 10 mM Mg

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
7 ml 标准小瓶，内壁圆润	Delta Scientific	200-007-20	推荐使用 34 个
小瓶托盘，21 mm 孔径	Delta Scientific	730-2001	4 个（4 × 8 网格）
24 mm 瓶盖	Delta Scientific	600-024-01	推荐使用 32 个
Corning 96 孔透明平底非结合表面微孔板	Corning	Corning 3651
厌氧培养箱（手套箱）			厌氧培养箱内的气体环境应为（97 % 氮气 ± 2 % 和 3 % 氢气 ± 2 %）
微孔板读数仪
微孔板读数仪用 450 (±10) nM 滤光片
微孔板读数仪用 500 (±10) nM 滤光片