利用比色法筛选细菌膜结合型焦磷酸酶抑制剂

摘要

来源： Vidilaseris, K., 等筛选 Thermotoga maritima 膜结合型焦磷酸酶抑制剂 视频实验杂志 (2019)

本视频演示了一种比色法检测，通过定量测定正磷酸盐的释放来筛选细菌膜结合型焦磷酸酶（mPPase）的抑制剂。该方法可用于鉴定抑制海栖热袍菌（Thermotoga maritima）mPPase的化合物，该酶是一种潜在的抗菌药物靶点。

方案

1. 检测准备所需的试剂

1. 配制亚砷酸盐-柠檬酸盐溶液。
   1. 称取5 g亚砷酸钠和5 g二水合柠檬酸三钠。
      注意：亚砷酸钠具有毒性，因此必须使用适当的个人防护装备并特别小心操作。作为预防措施，在未阅读并理解所有必要的安全注意事项之前，请勿进行操作。仅可在通风橱中操作，以避免吸入该化合物或其溶液的粉尘/蒸气。若吸入，请立即转移至空气新鲜处并寻求医疗救助。佩戴合适的化学防护眼镜、防护手套和防护服，以防止经口摄入以及眼睛或皮肤接触。若误吞食，请立即联系中毒控制中心或医生。若接触皮肤或眼睛，请用大量清水冲洗并寻求医疗救助。
   2. 溶于100 mL水中。
   3. 加入5 mL冰醋酸，混匀后加水定容至250 mL。
   4. 室温避光保存。
      注意：该溶液可稳定保存一年以上。
2. 配制溶液A和溶液B。
   1. 对于溶液A，将10 mL预冷的0.5 M HCl（盐酸）加入0.3 g抗坏血酸中，通过涡旋振荡使抗坏血酸溶解。
   2. 对于溶液B，将1 mL预冷的水加入70 mg四水合钼酸铵中，涡旋振荡至完全溶解。
      注意：两种溶液均需在冰上保存直至使用。为保证检测结果的一致性，两种溶液在冰上保存时间最长不超过一周。
3. 配制用于校准的磷酸盐（Pi）标准溶液，浓度分别为0 µM、62.5 µM、250 µM和500 µM。
   1. 向四个含有370 µL反应混合液的微量离心管中，分别加入0 µL、25 µL、50 µL和100 µL的5 mM Na₂HPO₄（磷酸氢二钠）二水合物溶液。
   2. 用水补足至1 mL。

一个96孔板的活性检测实验

注意：有关该检测方法的示意图流程，请参见图1。

1. 向10 mL溶液A中加入1 mL溶液B，涡旋混匀，置于冰上保存。
   注意： 该溶液应呈透明黄色。使用前将溶液A和溶液B置于冰上至少30分钟。然而，需在3小时内使用，因长期存放会导致溶液变质。
2. 加入40 µ0 L µM，62.5 µM, 250 µM 和 500 µ使用多通道移液器将 M Pi 标准品以每组三个重复加入管条中。
   注意： 未添加Pi的反应混合物将用作空白对照。
3. 加入25 µ使用多通道移液器将化合物溶液加入到试管条中。
   注意： 每种化合物设置三个不同浓度，每个浓度设三个复孔，足以初步估算半数最大抑制浓度（IC50）。若需更精确地测定IC50，可使用八个不同浓度的化合物。对于未受抑制的酶，用等体积的水替代化合物溶液。以2.5 µM，25 µM，以及250 µ使用了咪唑二磷酸（IDP）钠盐的摩尔浓度。
4. 加入15 µ使用多通道移液器将 L 型 mPPase（膜结合型焦磷酸酶）溶液混合物加入到管条中（含 Pi 标准品的管除外）。
5. 用粘性封板膜密封管条。裁剪封板膜以分离每条管条。
6. 将样本在 71 ℃ 预孵育 5 分钟 °C. 将样品以每条间隔20秒的顺序置于加热块上，以尽量减少后续步骤中的时间消耗。
7. 每条试纸，打开粘性封条，加入10 µ使用多通道移液器加入 2 mM 焦磷酸钠二碱液 L，上下吹打混匀 5 次×再次使用相同的封膜将试管条密封。
   注意： 此步骤最初可能难以在20秒内完成；然而，经过若干次实验后会变得更容易。
8. 在71℃孵育 °5 分钟，C
9. 将样品以每条间隔20秒的频率放置于冷却装置上。冷却10分钟，但在冷却5分钟后，需短暂离心每条样品，以去除封膜下方的水滴，随后将其放回冷却装置，并揭去封膜。
   注意： 冷却装置可通过将一个96孔PCR（聚合酶链式反应）板放置在聚苯乙烯培养皿（直径150 mm）上简单制成 × 15 mm）中，注满水并冷冻至少1小时。应在开始检测前约5分钟将冷却装置从冷冻箱中取出。切勿在样品冷却前立即取出冷却装置，否则会导致反应混合物冻结，从而阻碍显色反应的进行。
10. 冷却10分钟后，加入60 µ溶液A与溶液B各L，用移液器上下吹打混合5次×并将管条保留在冷却装置上10分钟。
11. 加入90 µ加入砷酸盐-柠檬酸溶液 L，室温下静置至少 30 分钟，以产生稳定的蓝色。
    警告： 由于亚砷酸钠具有毒性，所有含亚砷酸钠的溶液在任何时候都应格外小心处理。因此，亚砷酸盐-柠檬酸盐溶液的添加应在通风橱中进行。
12. 分配 180 µ将每种反应混合物各 L 加入透明的 96 孔聚苯乙烯微孔板中。
13. 使用微孔板分光光度计在860 nm处测定每个孔的吸光度。

结果

图1：96孔板格式中TmPPase抑制活性测定的示意图。 红色数字表示按照实验方案的测定步骤，蓝色箭头表示时间间隔顺序。TmPPase：来自嗜热细菌Thermotoga maritima的mPPase。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
粘合密封膜	Thermo Scientific	AB0558
四水合七钼酸铵	Merck	F1412481 636
抗坏血酸	Sigma-Aldrich	95212-250G
BioLite 96孔多孔板	Thermo Scientific	130188
二甲基亚砜（DMSO）	Merck	1167431000
8联PCR管条（0.2 ml，无盖，120个）	Nippon genetics	FG-028
乙醇	Merck	1009901001
冰醋酸	Merck	1000631011
盐酸	Sigma-Aldrich	258148-500ML
亚氨基三磷酸钠盐	Sigma-Aldrich	I0631-1G
氯化镁	Sigma-Aldrich	8147330500
96孔PCR板（Multiplate）	Bio-Rad	MLL9651
MultiSkan Go	Thermo Scientific	10680879
Nepheloskan Ascent（型号750）	Labsystems
聚苯乙烯培养皿（尺寸150 mm × 15 mm）	Sigma-Aldrich	P5981-100EA
氯化钾	Merck	104936
Prism 6 软件	GraphPad
QBT2 加热模块	Grant Instruments
偏亚砷酸钠	Fisher Chemical	12897692
磷酸氢二钠（Pi）	Sigma	S0876-1KG
焦磷酸钠	Fluka	71501-100G
二水合柠檬酸三钠	Fluka	71404-1KG