细菌孢子内膜发芽蛋白的可视化

Abstract

资料来源：温，J.，Pasman等人，枯草芽孢杆菌孢子中生发体和内膜的可视化。J.Vis.Exp。 （2019年）

该视频演示了如何使用结构化照明显微镜获取三维荧光图像，这些图像揭示了细菌孢子内发芽蛋白的组织。

Protocol

1. 发芽蛋白成像（时间：1小时）
   1. 在配备100倍油物镜（数值孔径= 1.49），CCD（电荷耦合器件）相机和图像分析软件（见 材料表）的结构照明显微镜（见 材料 表）上捕获孢子的透射和荧光图像以及红色和黄绿色羧酸盐修饰的荧光微球的混合物（见 材料表).在室温下生成所有图像，不受环境光的干扰。确保在成像前始终用 75% 乙醇清洁 100 倍物镜和载玻片。
   2. 聚焦 100 nm（直径）荧光微球，并通过调整 100 倍物镜上的校正环来优化点扩散函数 （psf），直到获得对称的 psf，从而最大限度地减少图像模糊。psf 是脉冲响应或成像系统对点源或点物体的响应。
   3. 选择具有大约 10 个圆形荧光微球的视场。对 561 nm 和 488 nm 激发波长应用光栅焦点调整，作为图像分析软件的指南。
   4. 用透射光聚焦孢子，并在 16× 平均模式下捕获透射光图像，每张图像的曝光时间为 200 毫秒。
   5. 使用照明模式“3D-SIM”捕获孢子的 3D-SIM 原始荧光图像，相机设置为读出模式电子倍增 （EM） 增益 10MHz（14 位）和 EM 增益（175）。用 561 nm 激光以 20% 的激光功率和 400 ms 的照明时间激发 PS4150 孢子中的 FM4-64 探头。
   6. 分别用30%激光功率的561nm激光激发KGB80孢子中的GerKB-mCherry和GerD-GFP1 s，以60%激光功率激发488nm激光3 s。Z-Stack 设置处于从上到下的模式，0.2 μm/步长。
      注意： 应用这些激光参数来确保直方图窗口的最大亮度值约为 4,000。

Materials