细菌芽孢内膜中萌发蛋白的可视化

摘要

来源： 文，J.，帕斯曼， 等人， 芽孢体及内膜的可视化 枯草芽孢杆菌 孢子。 视频实验杂志 (2019)

本视频展示了如何利用结构照明显微镜获取三维荧光图像，以揭示细菌芽孢内萌发蛋白的空间组织结构。

方案

1. 萌发蛋白成像（用时：1 小时）
   1. 在结构照明显微镜下捕获孢子以及红色和黄绿色羧基修饰荧光微球混合物的透射光与荧光图像（参见 材料表配备100倍油镜（数值孔径 = 1.49）、CCD（电荷耦合器件）相机和图像分析软件（参见 材料表）。在室温下生成所有图像，并避免环境光干扰。成像前务必使用75%乙醇清洁100倍物镜和载玻片。
   2. 聚焦于100 nm（直径）的荧光微球，并通过调节100倍物镜上的校正环来优化点扩散函数（psf），直至获得对称的psf，从而最大限度地减少图像模糊。点扩散函数（psf）是指成像系统对点光源或点状物体的脉冲响应，即系统的响应函数。
   3. 选择一个包含约10个圆形荧光微球的视野。以561 nm和488 nm激发波长的光栅聚焦调整作为图像分析软件的参考。
   4. 使用透射光聚焦孢子，并在16×平均模式下，以每次曝光200 ms的参数采集透射光图像。
   5. 使用“3D-SIM”照明模式，以电子倍增（EM）增益10 MHz、14位读出模式和EM增益175的相机设置，采集孢子的3D-SIM原始荧光图像。采用561 nm激光（激光功率20%）、照射时间400 ms，对PS4150孢子中的FM4-64探针进行激发。
   6. 使用561 nm激光（30%激光功率，1 s）激发KGB80芽孢中的GerKB-mCherry，使用488 nm激光（60%激光功率，3 s）激发GerD-GFP。Z-栈设置为从上到下模式，步长0.2 µm。
      注意： 应用这些激光参数以确保直方图窗口的最大亮度值约为 4,000。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
空气干燥的载玻片	Menzel Gläser	630-2870
APO TIRF N20R8 100× 油镜（NA=1.49）
Bacillus subtilis KGB80 (PS4150 gerKA gerKC gerKB-mCherry cat, gerD-gfp kan)
Bacillus subtilis PS4150 (PS832 ΔgerE::spc, ΔcotE::tet)
羧基修饰的FluoSpheres微球	Invitrogen, 0.1 μm	F8803
FM4-64	Thermo Fisher Scientific	F34653
非离子密度梯度介质Histodenz	Sigma-Aldrich	D2158
Image J
iXON3 DU-897 X-6515 CCD相机	Andor Technology		https://imagej.net/Welcome
显微镜成像软件	Nikon, 日本	NIS-Element AR 4.51.01
超纯去离子水（MilliQ）	Millipore	Milli-Q IQ 7003
Nikon Eclipse Ti显微镜
精密盖玻片	Paul Marienfeld	117650
50 mL螺口管	Thermo Fisher Scientific		Nunc TM