用于研究透明质酸与癌细胞相互作用的微图案化表面

摘要

介绍了一种可实现癌细胞与外源性透明质酸（HA）相互作用高分辨率分析的新方法。通过结合碳二亚胺化学与微接触印刷技术，制备出图案化表面。

摘要

癌症的侵袭与进展涉及一种运动性细胞表型，该表型受到肿瘤微环境中生长因子/细胞因子及细胞外基质（ECM）成分的复杂调控。透明质酸（HA）是一种间质ECM成分，已知可通过增强肿瘤细胞的侵袭、生长和血管生成来促进肿瘤进展¹。HA与其细胞表面受体CD44相互作用，可触发一系列信号转导事件，促进肿瘤细胞的增殖、存活和迁移，从而增加转移扩散的风险^2-3。HA是一种带负电荷、非硫酸化的糖胺聚糖，由D-葡萄糖醛酸和D-N-乙酰氨基葡萄糖重复单元组成。由于其重复的二糖单元上含有羧基和羟基，天然HA具有较强的亲水性，并易于进行化学修饰，例如引入硫酸基团以实现光反应性固定^4-5。以往关于将HA固定于表面的研究，利用了HA及其硫酸化衍生物的生物抗性特性，以调控细胞在表面的黏附行为^6-7。在这些研究中，细胞优先黏附于非HA图案化区域。

为了分析细胞与外源性透明质酸（HA）的相互作用，我们开发了具有图案化的功能化表面，可实现对癌细胞与HA相互作用的可控研究及高分辨率可视化。我们采用微接触印刷技术（uCP）在玻璃表面定义出离散的HA图案区域。通过“锚定”策略，利用碳二亚胺交联化学法将HA固定在表面⁸。玻璃表面经氨基硅烷微接触印刷后，与含有优化比例的EDC和NHS的HA溶液反应，从而在图案化阵列中实现HA的固定。将碳二亚胺化学法与mCP技术结合，可将HA特异性地固定在预定区域，制备出适用于体外（in vitro）研究的表面。结肠癌细胞和乳腺癌细胞均可自发地与HA微图案表面发生相互作用。癌细胞在24小时内发生黏附，并在48小时内出现增殖。利用HA微图案表面，我们证实癌细胞的黏附是通过HA受体CD44介导的。此外，HA图案化表面适用于扫描电子显微镜（SEM）观察，可对癌细胞在HA图案上的黏附突起和铺展进行高分辨率成像，从而分析癌细胞在外源性HA上的运动能力。

方案

1. 用于微图形印章制备的标准光刻技术

1. 用乙醇冲洗新的硅片，并用气流吹干。在整个过程中使用镊子操作硅片，以防止表面产生缺陷。
2. 将硅片转移至旋涂仪，并在其表面覆盖 SU-2025 负性光刻胶。光刻胶应覆盖至少 80% 的硅片表面。先以 600 rpm 旋涂 10 秒，再以 3000 rpm 旋涂 30 秒。由于光刻胶对光敏感，从此时起应关闭室内照明。
3. 将涂有光刻胶的硅片转移至加热板，在 95°C 下进行“前烘”3 分钟。从加热板上取下后，静置冷却 1 分钟。
4. 将带有目标图案的预制掩模置于涂有光刻胶的硅片表面，并用紫外光（UV，350–450 nm）照射 20 秒。
5. 将硅片再次转移至加热板，在 110°C 下进行“后烘”6 分钟。
6. 打开灯光，将硅片从加热板上取下。此时应可观察到清晰的图案。
7. 用 SU-8 光刻胶显影液小心冲洗硅片。用显影液冲洗 3 次后，再用乙醇冲洗。若仍有白色残留物，可重复使用光刻胶显影液冲洗，或直接将硅片浸入显影液中 2 分钟，随后继续用乙醇冲洗。最后用水清洗并用气流吹干。
8. 按 10:1 的质量比混合聚二甲基硅氧烷（PDMS）弹性体溶液与固化剂。在 900 rpm 下离心 5 分钟，以去除气泡。
9. 将带有图案的硅片放入培养皿中，将 PDMS 倒在硅片上。若存在气泡，将其置于真空干燥器中抽真空数分钟，直至气泡消失。
10. 在室温（RT）下固化过夜，形成互补的弹性体印章。若 12 小时后 PDMS 仍未完全固化，可将其置于 60°C 烤箱中加热 30 分钟。
11. 小心地将 PDMS 从硅片上剥离。使用刀片将印章切割至所需尺寸。在乙醇中超声处理 15 分钟。硅片可多次重复使用，以制备新的弹性体印章。

2. HA 微图案化

1. 将载玻片放入等离子清洗仪中清洗5分钟。将所有载玻片放入腔室并抽真空5分钟，然后让少量氧气进入腔室。开启等离子清洗仪清洗5分钟。用镊子将载玻片从等离子清洗仪中取出，并放入培养皿中。
2. 在进行等离子清洗的同时，将聚二甲基硅氧烷（PDMS）印章在乙醇中超声处理15分钟。
3. 在15 mL离心管中配制新鲜的3%（v/v）3-氨基丙基三甲氧基硅烷（APTMS）乙醇溶液（溶剂为95% v/v乙醇）。室温下静置反应5分钟，使其形成硅醇基团。
4. 将PDMS印章图案面向上固定在旋涂仪卡盘上，将APTMS溶液覆盖于图案表面，以3500 rpm旋涂30秒。操作时仅接触PDMS印章边缘，避免触碰图案表面。
5. 将APTMS溶液转移至经等离子清洗的玻璃表面：将印章图案面朝下置于玻璃一端，轻轻滑动并按压PDMS，使其完全贴合玻璃表面，保持接触1分钟。
6. 轻柔取下PDMS印章，将带有图案的载玻片在室温下孵育30分钟。用乙醇冲洗图案表面，并用空气吹干。将PDMS印章再次超声处理15分钟，以去除残留的APTMS。
7. 将样品在烘箱或加热板上于115°C加热1小时。随后用乙醇冲洗，并用空气吹干。
8. 配制新鲜的20%（v/v）聚乙二醇（PEG）硅烷溶液，即将2-[甲氧基(聚乙二醇)丙基]三甲氧基硅烷溶于甲苯中。该溶液将用于形成围绕图案的非黏附区域。
9. 将带有图案的载玻片转移至玻璃培养皿中，在加热板上75°C条件下于PEG-硅烷溶液中孵育45分钟。随后依次用甲苯、水冲洗，并用空气吹干。
10. 在生物安全柜中使用紫外杀菌照射消毒1小时。此后所有操作均需在生物安全柜中进行，以维持无菌状态。
11. 配制无菌的透明质酸（HA）水溶液：
    10 mM 1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺（EDC）
    5 mM N-羟基琥珀酰亚胺
    50 μg/mL 荧光素标记的HA
12. 在无菌条件且避光的情况下，将HA溶液滴加至带有图案的玻璃基底上。图案化基底需静置16–24小时，避免扰动。
13. 吸除HA溶液，用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤，随后加入含1%牛血清白蛋白（BSA）的PBS溶液覆盖表面，孵育1小时。此时表面已准备好用于细胞培养。

3. 在HA微图案化表面上进行细胞培养

1. 根据制造商的说明，扩增 MDA-MB-231 人乳腺癌细胞和 LS174T 结肠直肠癌细胞。
2. 将癌细胞的单细胞悬液以每 18.75 cm² 玻璃表面积 0.4 至 1×10⁶ 个癌细胞的密度接种到固定化的透明质酸（HA）表面。在含 5% CO₂ 的湿润化培养箱（37 °C）中孵育。细胞黏附应在 24 小时内发生，可通过倒置光学显微镜观察。
3. 细胞培养表面可在标准培养箱条件下维持最多 5 天。每隔一天更换一次培养基。可通过倒置光学显微镜观察细胞形态和生长情况。可应用其他细胞检测方法分析细胞对 HA 表面的反应。

4. 代表性结果：

用于将透明质酸（HA）共价固定于APTES图案化玻璃载片的碳二亚胺化学反应如图1A所示。EDC是一种零长度交联剂，可与HA的羧基反应生成胺反应性中间体。由于该中间体易发生水解，因此加入NHS以提高碳二亚胺反应效率。当HA溶液与APTES微图案相互作用时，HA中间体与APTES的伯胺基团之间形成稳定的酰胺键。使用荧光显微镜观察HA图案化表面的示例以及ImageJ荧光强度分析结果，展示了HA的图案化固定效果（图1B-C）。

HA 微图案化表面可用于研究癌细胞与外源性 HA 的相互作用。MDA-MB-231 人乳腺癌细胞系和 LS174t 人结肠癌细胞系均优先黏附于 HA 微图案化区域（图 2）。利用扫描电子显微镜进行高分辨率成像，可用于分析培养细胞与固定化 HA 表面之间的相互作用（图 3）。

图1 透明质酸（HA）微图案化表面。（A）HA功能化表面构建过程的示意图；（B）荧光素（绿色）标记的HA微图案化表面的荧光图像；（C）使用ImageJ软件生成的三维像素分布图，显示离散的HA图案。比例尺 = 100μm。经Elsevier许可改编自⁹。

图2. 癌细胞在透明质酸（HA）微图案化表面的黏附。结肠癌（A）和乳腺癌（B）细胞在培养24小时后优先黏附于HA区域。经Elsevier许可改编自⁹。

图3. 癌细胞与HA的相互作用。（A）结肠癌细胞（A）在HA表面培养后的扫描电子显微镜图像，左图为低倍镜视野，右图为左图方框区域的高倍镜视野；（B）乳腺癌细胞（B）在HA表面培养后的扫描电子显微镜图像，左图为低倍镜视野，右图为左图方框区域的高倍镜视野。

讨论

本文介绍的透明质酸（HA）微图形化方法可用于研究细胞与外源性HA的相互作用。已知HA在癌症进展中发挥关键作用¹，但针对癌细胞在二维HA图案化表面相互作用的研究仍十分有限。对外源性HA微图案进行可控性研究，可实现对癌细胞黏附、生长和迁移的高分辨率可视化观察，有助于进一步阐明癌症发生发展的基本机制。

通过结合碳二亚胺化学与微接触印刷技术，我们开发了具有明确透明质酸（HA）图案的表面，用于研究癌细胞的相互作用。该方法可制备出图案一致的表面，适用于细胞培养及多种分析技术，包括但不限于免疫荧光染色、扫描电子显微镜观察、抑制实验、迁移实验等。

此外，光刻技术可轻松实现任意所需图案的微加工，从而控制透明质酸（HA）在特定应用中的固定化。例如，制备具有线性条纹的聚二甲基硅氧烷（PDMS）印章，可将HA以线性阵列形式固定，有助于分析细胞沿图案化HA的迁移行为。

尽管我们主要利用该方法阐明癌细胞与透明质酸（HA）的相互作用，但该技术同样适用于研究其他细胞类型与HA...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
SU-2025 光刻胶	MicroChem Corp.	Y111069
SU-8 显影液	MicroChem Corp.	Y020100
Sylgard 184	Dow Corning
3-氨丙基三甲氧基硅烷 (APTMS)	Sigma-Aldrich	281778
2- [甲氧基(聚乙二醇)丙基] 三甲氧基硅烷 (Peg-silane)	Gelest Inc.	SIM6492.7
1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺	Thermo Fisher Scientific, Inc.	22980
N-羟基琥珀酰亚胺 (NHS)	Thermo Fisher Scientific, Inc.	24500
荧光素标记透明质酸 (FL-HA)	Sigma-Aldrich	F1177	用 10 ml 去离子水重悬
MDA-MB-231 乳腺癌细胞	ATCC	HTB-26
LS174t 结肠癌细胞	ATCC	Cl-188