方法文章

用于研究透明质酸与癌细胞相互作用的微图案化表面

DOI：

10.3791/2413

⸱

2010年12月22日

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1Department of Chemical and Biomolecular Engineering, Johns Hopkins Physical Sciences Oncology Center and Institute for NanoBioTechnology, Johns Hopkins University

本文内容

摘要

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介绍了一种可实现癌细胞与外源性透明质酸（HA）相互作用高分辨率分析的新方法。通过结合碳二亚胺化学与微接触印刷技术，制备出图案化表面。

摘要

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癌症的侵袭与进展涉及一种运动性细胞表型，该表型受到肿瘤微环境中生长因子/细胞因子及细胞外基质（ECM）成分的复杂调控。透明质酸（HA）是一种间质ECM成分，已知可通过增强肿瘤细胞的侵袭、生长和血管生成来促进肿瘤进展1。HA与其细胞表面受体CD44相互作用，可触发一系列信号转导事件，促进肿瘤细胞的增殖、存活和迁移，从而增加转移扩散的风险2-3。HA是一种带负电荷、非硫酸化的糖胺聚糖，由D-葡萄糖醛酸和D-N-乙酰氨基葡萄糖重复单元组成。由于其重复的二糖单元上含有羧基和羟基，天然HA具有较强的亲水性，并易于进行化学修饰，例如引入硫酸基团以实现光反应性固定4-5。以往关于将HA固定于表面的研究，利用了HA及其硫酸化衍生物的生物抗性特性，以调控细胞在表面的黏附行为6-7。在这些研究中，细胞优先黏附于非HA图案化区域。

为了分析细胞与外源性透明质酸（HA）的相互作用，我们开发了具有图案化的功能化表面，可实现对癌细胞与HA相互作用的可控研究及高分辨率可视化。我们采用微接触印刷技术（uCP）在玻璃表面定义出离散的HA图案区域。通过“锚定”策略，利用碳二亚胺交联化学法将HA固定在表面8。玻璃表面经氨基硅烷微接触印刷后，与含有优化比例的EDC和NHS的HA溶液反应，从而在图案化阵列中实现HA的固定。将碳二亚胺化学法与mCP技术结合，可将HA特异性地固定在预定区域，制备出适用于体外（in vitro）研究的表面。结肠癌细胞和乳腺癌细胞均可自发地与HA微图案表面发生相互作用。癌细胞在24小时内发生黏附，并在48小时内出现增殖。利用HA微图案表面，我们证实癌细胞的黏附是通过HA受体CD44介导的。此外，HA图案化表面适用于扫描电子显微镜（SEM）观察，可对癌细胞在HA图案上的黏附突起和铺展进行高分辨率成像，从而分析癌细胞在外源性HA上的运动能力。

方案

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1. 用于微图形印章制备的标准光刻技术

  1. 用乙醇冲洗新的硅片，并用气流吹干。在整个过程中使用镊子操作硅片，以防止表面产生缺陷。
  2. 将硅片转移至旋涂仪，并在其表面覆盖 SU-2025 负性光刻胶。光刻胶应覆盖至少 80% 的硅片表面。先以 600 rpm 旋涂 10 秒，再以 3000 rpm 旋涂 30 秒。由于光刻胶对光敏感，从此时起应关闭室内照明。
  3. 将涂有光刻胶的硅片转移至加热板，在 95°C 下进行“前烘”3 分钟。从加热板上取下后，静置冷却 1 分钟。
  4. 将带有目标图案的预制掩模置于涂有光刻胶的硅片表面，并用紫外光（UV，350–450 nm）照射 20 秒。
  5. 将硅片再次转移至加热板，在 110°C 下进行“后烘”6 分钟。
  6. 打开灯光，将硅片从加热板上取下。此时应可观察到清晰的图案。
  7. 用 SU-8 光刻胶显影液小心冲洗硅片。用显影液冲洗 3 次后，再用乙醇冲洗。若仍有白色残留物，可重复使用光刻胶显影液冲洗，或直接将硅片浸入显影液中 2 分钟，随后继续用乙醇冲洗。最后用水清洗并用气流吹干。
  8. 按 10:1 的质量比混合聚二甲基硅氧烷（PDMS）弹性体溶液与固化剂。在 900 rpm 下离心 5 分钟，以去除气泡。
  9. 将带有图案的硅片放入培养皿中，将 PDMS 倒在硅片上。若存在气泡，将其置于真空干燥器中抽真空数分钟，直至气泡消失。
  10. 在室温（RT）下固化....

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讨论

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本文介绍的透明质酸（HA）微图形化方法可用于研究细胞与外源性HA的相互作用。已知HA在癌症进展中发挥关键作用1，但针对癌细胞在二维HA图案化表面相互作用的研究仍十分有限。对外源性HA微图案进行可控性研究，可实现对癌细胞黏附、生长和迁移的高分辨率可视化观察，有助于进一步阐明癌症发生发展的基本机制。

通过结合碳二亚胺化学与微接触印刷技术，我们开发了具有明确透明质酸（HA）图案的表面，用于研究癌细胞的相互作用。该方法可制备出图案一致的表面，适用于细胞培养及多种分析技术，包括但不限于免疫荧光染色、扫描电子显微镜观察、抑制实验、迁移实验等。

此外，光刻技术可轻松实现任意所需图案的微加工，从而控制透明质酸（HA）在特定应用中的固定化。例如，制备具有线性条纹的聚二甲基硅氧烷（PDMS）印章，可将HA以线性阵列形式固定，有助于分析细胞沿图案化HA的迁移行为。

尽管我们主要利用该方法阐明癌细胞与透明质酸（HA）的相互作用，但该技术同样适用于研究其他细胞类型与HA.......

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披露

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视频示意图经许可转载；版权所有 © Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA。Dickinson LE, Kusuma S, Gerecht S. 利用生物材料重建胚胎干细胞的分化微环境。Macromol. Biosci. 2010; 10月21日。[提前在线发表]。

致谢

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作者感谢约翰斯·霍普金斯大学表面分析实验室的使用支持，该实验室由美国国家科学基金会资助，作为材料研究科学与工程中心的一部分。LED 是 IGERT 培训项目学员及美国国家科学基金会研究生奖学金获得者。本研究部分由美国国立卫生研究院资助项目 U54CA143868 支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
SU-2025 光刻胶MicroChem Corp.Y111069
SU-8 显影液MicroChem Corp.Y020100
Sylgard 184Dow Corning
3-氨丙基三甲氧基硅烷 (APTMS)Sigma-Aldrich281778
2- [甲氧基(聚乙二醇)丙基] 三甲氧基硅烷 (Peg-silane)Gelest Inc.SIM6492.7
1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺Thermo Fisher Scientific, Inc.22980
N-羟基琥珀酰亚胺 (NHS)Thermo Fisher Scientific, Inc.24500
荧光素标记透明质酸 (FL-HA)Sigma-AldrichF1177用 10 ml 去离子水重悬
MDA-MB-231 乳腺癌细胞ATCCHTB-26
LS174t 结肠癌细胞ATCCCl-188

参考文献

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  1. Toole, B. P., Wight, T. N., Tammi, M. I. Hyaluronan-cell interactions in cancer and vascular disease. Journal of Biological Chemistry. 277, 4593-4596 (2002).
  2. Hamilton, S. R. The Hyalur....

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