通过电穿孔法转染野生型阿米巴并辅以细菌喂养

摘要

来源：Paschke, P., 等. 基因工程 盘基网柄菌 基于细菌筛选与生长的细胞研究。J. Vis. Exp. (2019)。

本视频演示了通过电穿孔将携带目的基因的质粒导入阿米巴细胞的操作步骤，随后在细菌补充培养基中进行恢复，以实现向野生型阿米巴高效递送基因。

方案

1. 设置 黏菌属 用于转染的细胞
   1. 培养 肺炎克雷伯菌 在SM（脱脂牛奶）培养基（营养丰富的培养基）中于室温过夜培养至汇合。培养物可在4 °C保存长达2周。
   2. 将约 400 µL 该细菌悬液加入 SM 琼脂平板中（蛋白胨 10 g/L；酵母提取物 1 g/L；葡萄糖 10 g/L；KH₂PO₄ 1.9 g/L；K₂HPO₄ x 3 H₂O，1.3 g/L；MgSO₄₄ 无水 0.49 g/L；1.7% 琼脂），均匀铺展。取无菌接种环，接种 黏菌属 细胞。将细胞铺在培养板的一侧边缘。
   3. 在22 °C下孵育平板2天，以确保获得足够大的生长区域用于转染。
      注意： 对于 盘基网柄菌 不产生明显生长区域的菌株（例如， Ax3、DH1 或 JH10），或对于缺乏经验的实验人员，可改用澄清平板。
   4. 取无菌接种环接种 盘基网柄菌 细胞（约 2-4 x 10⁵ 细胞）。将细胞转移至800 µL高密度 K. aerogenes 在SM中重悬细胞，通过移液吹打混匀。
   5. 转移 400 µL、200 µL、100 µL 和 50 µL 至新的 SM 琼脂平板上。向每个平板中额外加入 400 µL SM K. aerogenes 悬浮，均匀铺展，并干燥。
   6. 将培养皿在 22 °C 下孵育约 2 天，直至培养皿变得半透明。
      注意： 由于细菌生长速度较快，最初会形成致密的菌苔，随后变形虫会将培养皿中的细菌“清除”。该过程所需时间可能因菌株背景以及突变细胞在细菌上生长能力的不同而有所差异。

基于细菌筛选的Dictyostelium细胞转染

1. 准备平板 K. aerogenes 悬浮液，加入含有10 mL SorMC缓冲液的溶液 K. aerogenes 细菌培养至光密度（OD）₆₀₀ = 2（加入200 µL已制备的OD₆₀₀ = 100 K. aerogenes 将所需细菌浓度的储备液加入至一个10 cm经组织培养处理的培养皿中。
   注意： 此平板后续用于培养转染后的细胞 D. discoideum 细胞。或者，可使用6孔组织培养板。在转染附加体质粒的情况下，6孔组织培养板更具资源利用效率。使用2 mL的 K. aerogenes SorMC（OD₆₀₀ 每孔 2) 悬液。
2. 制备 盘基网柄菌 细胞
   1. 使用10 µL一次性接种环，从培养平板或澄清平板的生长区域（约3 cm，透明圈边缘）刮取细胞，转移至含有1 mL冰上预冷H40缓冲液的1.5 mL离心管中。
      注意： 从澄清平板中收获细胞的时机至关重要。收获过早会导致细胞量不足，而收获过晚则会增加获得部分发育细胞的风险。
   2. 以 1,000 × g 离心 2 分钟洗涤细胞 g 或以10,000 ×g离心2秒 g弃去上清液，将细胞重悬于H40缓冲液中，调整终浓度为2-4 x 10⁷ 细胞/mL。整个转染过程需保持细胞处于低温环境。使用冰水混合物以确保离心管与冰直接接触。
3. 电穿孔
   1. 向含有1-2 µg DNA（脱氧核糖核酸）的离心管中加入100 µL细胞。用移液器轻柔地上下吹打混匀。
   2. 将细胞/DNA混合物转移至预冷的电穿孔比色皿（2 mm 间隙）中。
   3. 使用以下方波参数对细胞进行电穿孔：350 V，8 ms，2次脉冲，脉冲间隔1 s。
      注意： DNA 加入量不得超过 2 µg。过量 DNA 对细胞具有毒性，并会降低转染效率。加入的 DNA 总体积不应超过 5 µL。
   4. 将细胞立即转移至先前准备好的10 cm培养皿中 K. aerogenes SorMC，并让细胞恢复5小时。
      注意： 在倒置显微镜下观察培养皿中的细胞。电穿孔后细胞呈圆形，但在约30分钟后，细胞已充分贴附于表面，将恢复为阿米巴样形态。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Eppendorf 微型离心机 5424/5424R	ThermoScientific	05-400-002
Eppendorf 5702R 离心机，配备 A-4-38 型转子	ThermoScientific	12823252
Foruna 安全柜 - SCANLAF	Labogene
BioPhotometer Plus 核酸蛋白测定仪	Eppendorf
CLSM 710 激光共聚焦显微镜	Zeiss
纯化琼脂	Oxoid	LP0028
SM 液体培养基	Formedium	SMB0102
2x LB 液体培养基	Formedium	LBD0102
HEPES 游离酸	Sigma Aldrich/Merck	391340 EMD
KH₂PO₄	VWR	P/4800/53
Na₂HPO₄ 2H₂O	VWR	10028-24-7
MgCl₂ 6H₂O	Sigma Aldrich/Merck	5982 EMD
CaCl₂ 2H₂O	Sigma Aldrich	442909
叶酸	Sigma Aldrich	F7876
KOH	VWR	26668.263
100 x 20 mm 组织培养皿，组织培养处理表面	Corning Incorporated	353003
2 mm 间隙电穿孔比色皿，长电极	Geneflow Limited	E6-0062
10 µl 接种环，蓝色，10 微升	ThermoScientific	129399
涂布棒，L 形，无菌	greiner bio-one	730190