单细胞细菌相互作用的可视化

摘要

来源：Yarringto, K. D., et al. 单细胞水平细菌种间相互作用的动力学可视化。J. Vis. Exp. (2020)

本视频演示了在琼脂糖凝胶垫下制备运动型与非运动型细菌共培养系统，用于活细胞成像。该方法展示了运动型细菌如何感知化学引诱物并侵入非运动型菌落，从而揭示细菌间的相互作用。

方案

1. 细菌细胞的制备与接种垫的接种

1. 测定每个亚培养物的光密度（OD₆₀₀），并将铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）用预热至37 °C的M8T培养基（Minimal Medium 8 + 胰蛋白胨）稀释至OD₆₀₀ = 0.03，金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）稀释至OD₆₀₀ = 0.10。将P. aeruginosa和S. aureus按1:1比例混合，并涡旋振荡。
   注意：若菌株需要抗生素，可在过夜培养和亚培养中添加，但在为成像而混合菌种时不应添加抗生素，以免影响共培养中的其他菌种。每种实验所用的生物体/质粒，均需事先确定质粒稳定性及抗生素对共培养中所有菌种的影响。
2. 用移液器将1 µL共培养液均匀滴加到预热的无菌35 mm玻璃盖玻片培养皿底部。
3. 使用无菌镊子从模具中取出硅胶切片。
4. 使用无菌刮铲从培养皿中取出凝胶垫。
   1. 将略微弯曲的刮铲插入凝胶垫边缘下方，同时将模具倒置，使其落入无菌培养皿盖上。
      注意：切勿强行推出凝胶垫，以免撕裂。注意记录凝胶垫的底面朝向。
5. 用90°角刮铲从底部将凝胶垫滑入接种了细菌的培养皿中，确保底面朝下。用90°角刮铲使凝胶垫与盖玻片完全贴合，并轻轻压出任何气泡。
6. 将湿润擦拭纸上的多余水分去除，放置在培养皿边缘周围，确保不接触凝胶垫。样品现可进行成像。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
琼脂糖垫
35 mm 玻璃底培养皿，带 20 mm 微孔，1.5 盖玻片	Cellvis	D35-20-1.5-N	一个用于琼脂糖垫模具，一个用于实验
圆锥形刮刀	VWR	82027-530
硅胶隔离器，按压密封，单孔，直径 2.0 mm，20 mm，硅胶/粘合剂	Sigma-Aldrich	S6685-25EA	用于琼脂糖垫模具
镊子	VWR	89259-944
M8T 最小培养基
D (+) 葡萄糖	RPI	G32045
KH₂PO₄	RPI	P250500
MgSO₄	Sigma-Aldrich	208094
NaCl	RPI	S23025
Na₂HPO₄·7H₂O	Sigma-Aldrich	230391
胰蛋白胨	BD Biosciences	DF0123173
细菌菌株
Pseudomonas aeruginosa PA14 (WT) pSMC21 (Ptac-GFP)	PMID: 9361441
Staphylococcus aureus USA300 LAC (WT)	PMID: 23404398		耐甲氧西林 USA300 CA 菌株 LAC，无质粒