利用非离子型去污剂相分离富集细菌脂蛋白

摘要

来源：Armbruster, K. M., Meredith, T. C. 细菌脂蛋白的富集及用于质谱结构测定的N端脂肽制备。J. Vis. Exp. (2018)

本视频展示了利用一种在升温时发生相分离的非离子型去污剂来富集细菌脂蛋白的方法。通过依次改变温度并进行离心，脂蛋白被选择性地分配至去污剂相中，而非脂蛋白类污染物则被去除。富集后的脂蛋白随后被沉淀、洗涤并重新悬浮，以用于后续应用。

方案

1. 通过 Triton X-114 (TX-114) 相分离法富集脂蛋白

1. 向细菌裂解液中加入TX-114表面活性剂，通过加入等体积的4%（vol/vol）表面活性剂冰冻Tris缓冲盐水/乙二胺四乙酸（TBSE）溶液，使终浓度达到2%（vol/vol），在冰上孵育1小时，每约15分钟轻轻颠倒混匀一次。
   注意：冷却后，上清液与表面活性剂可混溶。
2. 将离心管转移至37 °C水浴中孵育10分钟以诱导相分离。在室温下以10,000 × g离心10分钟，以维持双相分离状态。
3. 小心用移液器吸除上层水相并弃去。向下层表面活性剂相中加入冰冻TBSE，补足至原始体积，轻轻颠倒混匀。在冰上孵育10分钟。
4. 将离心管转移至37 °C水浴中孵育10分钟以再次诱导相分离，随后在室温下以10,000 × g离心10分钟。
5. 重复步骤1.3–1.4一次，共完成3次相分离。吸除上层水相并弃去。
6. 向表面活性剂相中加入1体积冰冻TBSE，以去除提取过程中形成的沉淀蛋白（可见于管底）。在4 °C下以16,000 × g离心2分钟，使不溶性蛋白形成沉淀。
   注意：样品应保持单相状态。若发生相分离，需重新冰浴并再次离心。该沉淀通常由非脂蛋白污染物组成，但也可保留用于进一步分析。
7. 立即将上清液转移至含有1250 μL 100%丙酮的新鲜2.0 mL微量离心管中。充分上下吹打，彻底清洗移液器吸头，因样品可能较黏稠。轻轻颠倒混匀，并在-20 °C过夜孵育，以沉淀脂蛋白。
8. 在室温下以16,000 × g离心20分钟，使脂蛋白形成沉淀，注意离心管的放置方向。脂蛋白将在管壁外侧形成一层薄而白色的膜状物。
9. 用100%丙酮洗涤沉淀两次。倾去丙酮，让样品自然风干。
10. 加入20–40 μL 10 mM Tris-盐酸缓冲液（pH 8.0）或标准Laemmli SDS-PAGE上样缓冲液，通过在管壁反复上下吹打，充分重悬沉淀的脂蛋白。用移液器吸头轻轻刮擦管壁，以使脂蛋白脱离。
    注意：脂蛋白不会溶解于Tris缓冲液中，而是形成悬浮液。
    1. 将脂蛋白储存于-20 °C，待用。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
丙酮	EMD	AX0116-6
乙二胺四乙酸（EDTA）	国药集团化学试剂	BP118
三羟甲基氨基甲烷盐酸盐（HCl）	国药集团化学试剂	BP152
吐温-114（Triton X-114）	Sigma-Aldrich	93422
氯化钠	Macron Fine Chemicals	7581-06