人诺如病毒细菌来源重组P结构域蛋白的纯化

摘要

来源： Leuthold, M. M., 等 人诺如病毒突出域的制备 E. coli 用于X射线晶体学。 J. Vis. Exp. (2016).

本视频展示了利用尺寸排阻色谱纯化重组人诺如病毒P结构域的方法，重点阐述了基于不同分子量物质对色谱柱孔隙通透性的差异，实现目标蛋白与高分子量及低分子量杂质的分离。通过紫外吸光度监测分离过程，并对洗脱组分进行SDS-PAGE分析以确认纯化效果。

方案

第3步 纯化步骤

1. 使用GFB（凝胶过滤缓冲液）清洗高效液相色谱（HPLC）纯化系统的泵和管路，并对尺寸排阻色谱（SEC）柱（见材料列表）进行预平衡。
2. 使用超大进样环（最多12 ml）或普通进样环（最多3 ml），以1 ml/min的流速将P结构域注入色谱柱，具体选择取决于浓缩样品的体积。进样完成后，将流速提高至2.5 ml/min。
3. 当光密度（OD）上升且P结构域开始从色谱柱中洗脱时，收集每份1.5 ml的组分。使用12%的SDS-PAGE凝胶检测各组分（图1A和1B）。仅合并最纯的组分，并浓缩至约3 mg/ml和约8 mg/ml。
   注意：在约110 ml（空体积）之后，大多数杂质已从填料体积为320 ml的SEC柱中洗脱。P结构域通常以二聚体形式洗脱。P结构域二聚体的洗脱时间/体积取决于SEC柱的制备级（pg）。

结果

图1. 第三步纯化过程的示意图及代表性结果。
使用尺寸排阻色谱（SEC）进行P结构域洗脱的色谱图及其对应的SDS-PAGE结果。黑色数字表示被收集的组分。A) SEC柱分离示意图（SEC介质以灰色球体表示）。12% SDS-PAGE显示了在SEC洗脱过程中被收集的各组分中存在的蛋白质，这些组分随后被...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
P结构域DNA	Life Technologies		GeneArt基因合成
Vivaspin 20	GE Healthcare	多种	使用截留分子量为10 kDa、30 kDa和50 kDa的超滤管
HiLoad 26/600 Superdex 75 PG	GE Healthcare	28-9893-34	尺寸排阻色谱柱（SEC柱）