负离子交换色谱法选择性纯化细菌蛋白

摘要

来源：Kuo, T., et al. 一步法负向色谱纯化在Escherichia coli中过表达的Helicobacter pylori中性粒细胞激活蛋白（批处理模式）。J. Vis. Exp. (2016)

该视频展示了一种负向层析技术，用于从细菌裂解液中纯化一种与毒力相关的蛋白质。通过在缓冲溶液中使用带正电荷的树脂，宿主细胞蛋白被选择性地保留，而接近中性的目标蛋白则不结合，随流穿液被收集。该方法可实现目标蛋白的有效分离与回收，适用于后续应用。

方案

1. 在大肠杆菌（E. coli）中表达重组HP-NAP

1. 准备含有NAP DNA序列的质粒pET42a-NAP 幽门螺杆菌 幽门螺杆菌中性粒细胞激活蛋白（HP-NAP） H. pylori 26695 菌株，方法如前所述。制备含有目标点突变 HP-NAP DNA 序列的质粒。
2. 将上述DNA质粒10 ng转化入 E. coli 将BL21 (DE3) 感受态细胞在42 °C下热激45秒，涂布于含50 µg/ml卡那霉素的LB琼脂平板，37 °C培养16小时。
3. 将单菌落分别接种至含有5 ml LB肉汤和50 µg/ml 卡那霉素的独立试管中，在37 °C、170 rpm振荡条件下培养16小时，作为预培养物。
4. 将上述预培养的菌液2 ml接种至含有50 µg/ml卡那霉素的200 ml LB液体培养基中，置于1 L锥形瓶内。将接种后的培养瓶在37 °C、170 rpm振荡条件下培养约2小时，直至紫外-可见光（UV/VIS）分光光度计测定的600 nm处吸光度达到约0.4–0.5。
5. 向上述培养物中加入80 µl的1 M异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷（IPTG），使终浓度为0.4 mM，以诱导HP-NAP的表达。继续培养3小时，直至600 nm处的吸光度达到约1.6–1.7。
6. 在 4 °C 条件下以 6,000 x g 离心 15 分钟，去除上清液。将细胞沉淀在 −70 °C 保存，直至纯化。

2. 含HP-NAP可溶性蛋白组分的制备

注意：以下所有步骤均在 4 °C 下进行。

1. 将方案步骤1.6中制备的50 ml细胞沉淀在4 °C下重新悬浮于20 ml含0.13 mM苯甲基磺酰氟（PMSF）、0.03 mM N-对甲苯磺酰-L-赖氨酰氯甲基酮（TLCK）和0.03 mM N-对甲苯磺酰-L-苯丙氨酰氯甲基酮（TPCK）的20 mM Tris-HCl（pH 9.0）、50 mM NaCl溶液中，操作方法同前文所述。
2. 将细菌悬液在4 °C下通过高压均质机处理7次，压力范围为15,000至20,000 psi，以裂解细菌细胞。
3. 将细胞裂解液在4 °C下以30,000 × g离心1小时，使用超速离心机分离可溶性和不溶性蛋白组分。将上清液转移至烧杯中，作为可溶性蛋白组分。
4. 按照制造商说明书，使用以牛血清白蛋白（BSA）为标准品的商用试剂盒，通过Bradford法测定可溶性蛋白组分的蛋白浓度。
5. 向从方案步骤2.3获得的20 ml可溶性蛋白组分中加入177.6 µl的1 N HCl，将其pH值从9.0调节至8.0。
6. 向上述蛋白溶液中加入20 mM Tris-HCl（pH 8.0）、50 mM NaCl，使最终蛋白浓度达到0.5 mg/ml。

3. 采用DEAE离子交换树脂负向模式批次层析法从E. coli纯化重组HP-NAP

1. 准备15 ml二乙氨基乙基（DEAE）树脂。
   1. 称取0.6 g DEAE树脂干粉，加入30 ml 20 mM Tris-HCl（pH 8.0）、50 mM NaCl溶液中，室温下悬浮至少1天。
   2. 在4 °C条件下，以10,000 × g离心1分钟。
   3. 移除并弃去上清液。
   4. 加入15 ml 20 mM Tris-HCl（pH 8.0）、50 mM NaCl溶液。
   5. 重复步骤3.1.2至3.1.4共四次。
   6. 将15 ml沉降后的树脂（在30 ml Tris缓冲液中形成50%悬浊液）于4 °C保存，以备后续使用。
      注意：以下所有步骤均在4 °C下进行。
2. 将步骤2.6中制备的45 ml可溶性蛋白加入15 ml树脂中，使用磁力搅拌器在4 °C下搅拌1小时。
3. 将蛋白/树脂悬浊液倒入装有活塞的塑料或玻璃层析柱中，静置使树脂自然沉降。
4. 打开活塞，使蛋白溶液依靠重力流过层析柱，直至柱内液面刚好位于树脂上方。收集流出液作为未结合组分，其中含有纯化的HP-NAP。
5. 向层析柱中加入15 ml预冷的20 mM Tris-HCl（pH 8.0）、50 mM NaCl溶液。
6. 打开活塞，使洗涤缓冲液依靠重力流过层析柱，直至液面刚好位于树脂上方。收集流出液作为洗涤组分。
7. 重复步骤3.5至3.6共四次，以收集额外的洗涤组分。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
材料
pET42a-NAP	N/A	N/A	制备方法见参考文献15的补充数据 http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0006291X08018317
E. coli BL21 (DE3)	Thermo Fisher Scientific Inc	C6000-03	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/C600003
卡那霉素	Amresco	25389-94-0	http://www.amresco-inc.com/KANAMYCIN-SULFATE-0408.cmsx
异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）	MD Biomedical Inc	101-367-93-1	http://www.antibody-antibodies.com/product_det.php?id=238064&supplier=search&name=IPTG%20
苯甲基磺酰氟（PMSF）	Sigma-Aldrich	10837091001	蛋白酶抑制剂
N-对甲苯磺酰-L-赖氨酰氯甲基酮（TLCK）	Sigma-Aldrich	T7254	蛋白酶抑制剂 http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t7254?lang=en®ion=TW
N-对甲苯磺酰-L-苯丙氨酰氯甲基酮（TPCK）	Sigma-Aldrich	T4376	蛋白酶抑制剂 http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t4376?lang=en®ion=TW
蛋白标准品（牛血清白蛋白）	Sigma-Aldrich	P5619	Bio-Rad蛋白测定法的标准蛋白 http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/p5619?lang=en®ion=TW
DEAE–Sephadex A-25 氯化物形式	Sigma-Aldrich	A25120	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a25120?lang=en®ion=TW
Spectrum/Por透析袋	Spectrum Laboratories	132720	截留分子量为14 kDa http://www.spectrumlabs.com/dialysis/RCtubing.html?Pn=132720;
E. coli DH5α	Thermo Fisher Scientific Inc	18265-017	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/18265017
U-2800双光束紫外/可见分光光度计	日立	N/A	已退市并升级为新型号 http://hitachi-hta.com/products/life-sciences-chemical-analysis/uvvisible-spectrophotometers
EmulsiFlex-C3高压均质机	Avestin Inc	C315320	http://www.avestin.com/English/c3page.html
日立工机 himac CP80WX通用超速离心机	日立工机株式会社	90106401	用于从E. coli裂解液中分离可溶性和不溶性蛋白组分 http://centrifuges.hitachi-koki.com/products/ultra/cp_wx/cp_wx.html