一种从Streptococcus mutans中纯化多聚组氨酸标签蛋白的实验方法

摘要

来源：Murata, T., 等. 变形链球菌中一种高分子量蛋白的纯化. J. Vis. Exp. (2019)

本视频演示了从Streptococcus mutans分泌的带有多聚组氨酸标签蛋白的纯化逐步操作流程。

方案

1. 通过硫酸铵沉淀法浓缩培养上清液中的蛋白质。
   注意：如果目标蛋白位于细胞内，则需从菌体中提取。
   1. 将细菌培养物（Streptococcus mutans）悬浮液在4 °C条件下以10,000 × g 离心20分钟。将上清液收集至一个3 L的玻璃烧杯中。
   2. 在2 L上清液中加入1,122 g硫酸铵（达到80%饱和度），使用磁力搅拌器剧烈搅拌。在4 °C下持续搅拌并使沉淀形成4小时或更长时间。
      注意：沉淀过程可过夜继续进行。
   3. 将含硫酸铵的沉淀溶液在4 °C下以15,000 × g 离心20分钟。倾去上清液。
   4. 用刮勺收集沉淀物，并转移至一个200 mL玻璃烧杯中。用35 mL结合缓冲液（50 mM NaH₂PO₄，300 mM NaCl，5 mM 咪唑，pH 8.0）重悬沉淀。
   5. 使用再生纤维素透析袋，在4 °C下对上述悬浮液进行透析，透析液体积为2,500 mL，并持续搅拌。2小时后更换透析液，并继续透析过夜。
   6. 再次更换透析液，继续透析2小时。
2. 将透析后的悬浮液在4 °C下以20,000 × g 离心10分钟。通过抽滤装置用膜滤器过滤上清液。将滤液转移至一个75 cm²的培养瓶中。
3. 采用固定化金属离子亲和层析（IMAC）从滤过的悬浮液中分离带有聚组氨酸标签的葡糖基转移酶-SI（GTF-SI）。
   1. 取2 mL镍离子负载的IMAC树脂悬液（约含1 mL树脂），转移至层析柱中，层析柱出口连接硅胶管。通过重力流去除保存液。
      注意：在整个IMAC过程中，切勿让树脂干燥。
   2. 向柱中加入3 mL蒸馏水洗涤树脂，再加入5 mL结合缓冲液以平衡树脂。
   3. 使用霍夫曼夹闭夹关闭流速。加入步骤2所得的5 mL滤液以制成悬液。
   4. 将全部悬液加回到剩余的滤液中，在4 °C下轻轻摇动混合30分钟。
   5. 将混合液重新加载到层析柱上，通过重力流去除未结合的液体。用20 mL结合缓冲液洗涤IMAC树脂。
      注意：在后续IMAC操作中，使用霍夫曼夹闭夹将流速调节至约2 mL/min。
   6. 用20 mL洗脱缓冲液（50 mM NaH₂PO₄，300 mM NaCl，500 mM 咪唑，pH 8.0）洗脱重组GTF-SI。
      注意：本方案可在此暂停。洗脱液应保存在4 °C。IMAC树脂可重复使用。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
离心超滤装置	Sartorius	VS2032	缓冲液置换和蛋白质浓缩
离心机	Kubota	7780II
层析柱	Bio-Rad	7321010	用于IMAC
透析膜夹	Fisher brand	21-153-100
透析袋	As One	2-316-06
咪唑	Wako	095-00015	结合缓冲液和洗脱缓冲液的配制
培养箱	Nippon Medical & Chemical Instruments	LH-100-RDS	温度设置：37 °C
微量离心机	Kubota	3740
氯化钠	Wako	191-01665	结合缓冲液和洗脱缓冲液的配制
磷酸二氢钠二水合物	Wako	192-02815	结合缓冲液和洗脱缓冲液的配制
氢氧化钠	Wako	198-13765	结合缓冲液和洗脱缓冲液的配制
硫酸铵	Wako	015-06737	硫酸铵沉淀
镍离子负载树脂	Bio-Rad	1560133	用于IMAC
膜过滤器	Merck Millipore	JGWP04700	0.2 µm 直径