微流控延时显微技术研究细菌对抗生素的持留现象

摘要

来源： Oms, T. 等. 抗生素耐受性的群体与单细胞分析 大肠杆菌. 视觉实验杂志. (2023)

本视频介绍了一种在微流控系统中监测表达荧光标记DNA结合蛋白的单个细菌细胞的实验方案。该方法展示了抗生素如何抑制大多数细菌细胞，而一部分持留细胞亚群则可在抗生素处理期间存活，并在抗生素去除后重新生长。

方案

微流控延时显微成像

注意： 以下部分描述了微流控板的制备，以及延时图像采集和图像分析的流程。本实验的目的是在单细胞水平上观察和分析抗生素处理后持留表型的表现。实验过程中收集的数据可根据所研究的具体问题和/或实验中使用的荧光报告系统，用于生成多种多样的结果。在本实验中，对细胞长度以及反映持留细胞与非持留细胞中拟核结构的 HU-mCherry 荧光强度进行了定量分析。

1. 用于微流控延时显微镜的细菌细胞培养
   1. 在玻璃试管（≥25 mL）中，接种一株单菌落至5 mL培养基（含0.4% MOPS甘油，根据需要添加选择性抗生素），置于摇床培养箱中，37 °C、180 rpm振荡培养过夜（15 h至19 h之间）。
   2. 第二天，测定OD值₆₀₀ nm，并在玻璃试管中用新鲜的、温度已调节的培养基（37 °C，MOPS 甘油 0.4%）稀释至终浓度 OD₆₀₀ 在37 °C、180 rpm条件下，于摇床培养箱中过夜培养（15至19小时），以获得次日处于对数生长期初期的菌液，OD600约为0.001。
2. 微流控板的制备与延时显微成像
   注意： 微流控实验可在市售的微流控装置（如本文所述）或实验室自制的微流控系统中进行。
   1. 从微流控板的每个孔中移除保存液（如有），并替换为新鲜培养基。
      注意： 如果微流控板含有废液出口孔，则应移除出口孔中的保存液，但不可用培养基替换。
   2. 使用歧管系统通过点击来密封微流控板 密封 按钮或通过微流控软件（首先选择 工具，随后 密封板).
      注意： 为确保板的密封，应通过手动将板均匀地压向流体控制装置来施加压力。若操作正确，ONIX2 界面将显示“已密封”提示。注意切勿对玻片施加任何压力，以避免损坏流体控制装置的风险。
   3. 密封后，执行第一次引物序列（点击 运行液体引物序列 在微流控软件界面上）。
      注意：运行液体引注序列 对应于1-5号孔在6.9 kPa压力下灌注5分钟，随后8号孔在6.9 kPa压力下灌注5分钟，最后6号孔在6.9 kPa压力下进行5分钟的终末灌注。 运行液体引物序列 可去除可能仍残留在连接不同孔的通道中的保存液。
   4. 将培养板置于显微镜恒温控制柜中，在所需温度（此处为 37 °C）下孵育至少 2 h，然后开始显微成像。
   5. 开始第二个 运行液体引物序列 在开始实验之前。
   6. 通过点击微流控软件界面上的“Seal off”来密封微流控板。用200 μL新鲜培养基替换1号和2号孔中的培养基，用200 μL含有抗生素的新鲜培养基（此处为5 μg·mL⁻¹的氧氟沙星（OFX））替换3号孔中的培养基。⁻¹），在第4孔和第5孔中加入200 μL新鲜培养基，在第6孔中加入200 µL新鲜培养基，在第8孔中加入200 μL培养样品（从步骤 1.2) 稀释至 OD₆₀₀ 在新鲜培养基中，0.01 的 nm。
   7. 按照所述方法密封微流控板 步骤 2.2 将其放置在显微镜柜内显微镜物镜上。
      注意： 在放置微流控板之前，务必在显微镜物镜上滴加一滴浸油。
   8. 在微流控软件中，单击 细胞加载 以便将细胞加载到微流控板中。
      注意： 该 细胞加载 该步骤包括：8号孔在13.8 kPa下灌注15秒，随后6号孔和8号孔在27.6 kPa下灌注15秒，最后6号孔在6.9 kPa下灌注30秒。微流控板中细胞的密度对实验至关重要。该微流控实验方案的第一部分是在新鲜培养基中培养细菌6小时，然后进行抗生素处理。经过6小时的培养后，细胞密度必须足够高，以检测到稀有的持留细胞（在本研究使用的条件下，持留细胞的产生频率为10⁻⁶）⁻⁴）。如果细胞密度过高，则难以区分单个细胞，从而无法进行精确的单细胞分析。由于细胞生长速率直接依赖于培养基，因此在启动实验前应评估显微镜视野中的细胞密度。
   9. 使用透射光模式设置最佳焦距，并选择若干细胞数量适宜的感兴趣区域（每个视野最多300个细胞）。
      注意： 选择至少40个ROI，以确保成像到稀有的持留细胞。
   10. 在微流控软件上，单击 创建实验方案以6.9 kPa压力向1-2号孔注入新鲜培养基6小时，随后以6.9 kPa压力向3号孔注入含抗生素的培养基6小时，最后以6.9 kPa压力向4-5号孔注入新鲜培养基20小时。
       注意： 稀释至 OD 的细菌培养物₆₀₀ 0.01 nm 能够使细菌在微流控腔室中生长 6 小时，确保细胞处于对数生长期。具体时间取决于加载步骤中引入微流控装置的细胞数量（参见步骤 2.8），可通过调整生长期的时长，使每个 ROI 中的细胞数量达到最多 300 个。由于持留现象较为罕见，增加每个 ROI 中的细胞数量有助于提高观察到持留细胞的概率。然而，每个 ROI 中的细胞数量不应超过 300 个，否则将使单细胞分析变得繁琐。
   11. 以15分钟为间隔，使用透射光和荧光报告基因的激发光源，进行时间序列显微成像。此处采用560 nm激发光源检测mCherry信号（580 nm LED，功率10%，滤光片00 [530–585 ex, 615LP em, Zeiss]，mCherry曝光时间为100 ms）。细胞成像采用与Zeiss兼容的Zen3.2软件进行。
3. 图像分析
   注意： 显微图像的打开与可视化采用开源的 ImageJ/Fiji 软件进行（https://fiji.sc/）。定量图像分析使用开源的 ImageJ/Fiji 软件和免费的 MicrobeJ 插件进行https://microbej.com）。在本方案中，使用了 MicrobeJ 5.13I(14) 版本。
   1. 打开计算机上的 ImageJ/Fiji 软件，将多通道时间序列显微图像拖入 Fiji 的加载栏中。使用 图像 > 颜色 > 制作复合材料 融合超堆栈的不同通道。如果延时实验的通道颜色不符合预期（例如，相差图像显示为红色而非灰色），请使用 图像 > 颜色 > 排列通道 为各通道应用适当的颜色。
   2. 打开MicrobeJ插件，使用手动编辑界面检测细菌细胞。删除自动检测到的细胞，逐帧手动勾画出目标持留细胞的轮廓。
      注意： 可采用不同设置来自动检测单个细胞。本研究中使用了手动检测，因为所分析的持留细胞会形成长丝状结构，而自动检测通常难以正确识别这些结构。
   3. 检测后，使用 结果 在 MicrobeJ 手动编辑界面中点击图标以生成 ResultJ 表格。保存 ResultJ 文件，并利用该文件获取单细胞分析中不同目标参数的洞察信息。在本实验方案中，导出了单个细胞的 HU-mCherry 荧光强度均值、细胞长度和细胞面积。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Axio Observer	Zeiss		倒置荧光显微镜
Fiji	ImageJ	https://fiji.sc/	图像处理软件；若用于发表，请引用 Schindelin 等人
E. coli K-12 MG1655 CF1648 (fnr+)		BE10	野生型参考菌株，实验室菌株
E. coli K-12 MG1655 CF1648 (fnr+) hupA-mCherry::FRT-kan-FRT		BE16	HU-mCherry 融合蛋白通过 P1 转导整合至内源位点，实验室菌株
CellASIC ONIX 微流控系统	Merck	CAX2-S0000	微流控系统
CellASIC ONIX 微流控板	Merck	B04A-03-5PK	微流控系统的培养板
CellASIC ONIX2 FG	Merck	ONIX2 1.0.1	微流控控制软件
CellASIC ONIX2 配管系统基础组件	Merck	CAX2-MBC20	配管系统
MicrobeJ	ImageJ/Fiji 插件	https://www.microbej.com/	显微图像分析插件。用于发表时请引用 Ducret 等人；检测参数设置：细菌：面积（μm²）：0.1–最大值；长度（μm）：0.5–最大值；宽度（μm）：0.6–最大值；范围（μm）：0.5–最大值；角度（rad）：0–0.3；其余所有参数均为 0–最大值。
Zeiss® 浸油 518F	Zeiss		用于提高显微镜分辨率的浸油
Zen3.2 Pro	Zeiss		显微图像采集与处理软件
氧氟沙星	Merck	82419-36-1	氟喹诺酮类抗生素，用于处理细菌细胞
CaCl₂·2H₂O	Merck	1.02382.0250	用于 MOPS 葡萄糖 0.4% 和 MOPS 甘油 0.4% 培养基
CoCl₂·6H₂O	Merck	1.02539.0100	用于 MOPS 葡萄糖 0.4% 和 MOPS 甘油 0.4% 培养基
CuSO₄·5H₂O	Merck	1.02790.0250	用于 MOPS 葡萄糖 0.4% 和 MOPS 甘油 0.4% 培养基
D-(+)-葡萄糖	Sigma Aldrich	G7021-1KG	MOPS 葡萄糖 0.4% 培养基的碳源
FeSO₄·7H₂O	VWR Chemicals	24244.232	用于 MOPS 葡萄糖 0.4% 和 MOPS 甘油 0.4% 培养基
甘油	Merck	56815	MOPS 甘油 0.4% 培养基的碳源
H₃BO₃	Sigma-Aldrich	B6768-1KG	用于 MOPS 葡萄糖 0.4% 和 MOPS 甘油 0.4% 培养基
K₂HPO₄	Merck	1.05099.1000	用于 MOPS 葡萄糖 0.4% 和 MOPS 甘油 0.4% 培养基
KOH	Merck	1.05029.1000	用于 MOPS 葡萄糖 0.4% 和 MOPS 甘油 0.4% 培养基
K₂SO₄	Merck	1.05153.0500	用于 MOPS 葡萄糖 0.4% 和 MOPS 甘油 0.4% 培养基
MgCl₂·6H₂O	Merck	1.05832.1000	用于 MOPS 葡萄糖 0.4% 和 MOPS 甘油 0.4% 培养基
MnCl₂·4H₂O	Merck	1.05927.0100	用于 MOPS 葡萄糖 0.4% 和 MOPS 甘油 0.4% 培养基
MOPS，游离酸 ULTROL® 级	Merck	475898-500GM	用于 MOPS 葡萄糖 0.4% 和 MOPS 甘油 0.4% 培养基
NaCl	Sigma-Aldrich	S5886-1KG	用于 MOPS 葡萄糖 0.4% 和 MOPS 甘油 0.4% 培养基
(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O	Merck	1.01180.0250	用于 MOPS 葡萄糖 0.4% 和 MOPS 甘油 0.4% 培养基
NH₄Cl	Merck	1.01145.0500	用于 MOPS 葡萄糖 0.4% 和 MOPS 甘油 0.4% 培养基
N-[三(羟甲基)甲基]-甘氨酸	Merck	1.08602.0250	用于 MOPS 葡萄糖 0.4% 和 MOPS 甘油 0.4% 培养基
ZnSO₄·7H₂O	Merck	1.08883.0500	用于 MOPS 葡萄糖 0.4% 和 MOPS 甘油 0.4% 培养基