微流控延时显微镜研究抗生素在细菌中的持久性

Abstract

资料来源： Oms， T. 等人。大 肠杆菌抗生素持久性的群体和单细胞分析。 J. Vis. Exp.（2023年）

该视频介绍了一种用于监测微流体系统中表达荧光标记的DNA结合蛋白的单个细菌细胞的方案。它说明了抗生素如何抑制大多数细胞，而持久性细胞亚群在治疗中存活并在去除抗生素后重新生长。

Protocol

微流控延时显微镜成像

注意： 以下部分介绍微流控板的制备以及延时图像采集和图像分析程序。本实验的目的是在单细胞水平上观察和分析抗生素治疗后的持久性表型。该实验期间收集的数据可用于生成广泛的结果，具体取决于所解决的问题和/或实验期间使用的荧光报告基因。在此描述的实验中，对细胞长度和胡-mCherry荧光进行了定量分析，反映了持久性和非持久性细胞中的类核组织。

1. 用于微流控延时显微镜的细菌细胞培养
   1. 将 5 mL 培养基（3-[N-吗啉]丙磺酸 （MOPS） 甘油 0.4%，如果需要，补充选择性抗生素）与玻璃管 （≥25 mL） 中的分离菌落接种，并将试管置于设置为 37 °C 和 180 rpm 的摇动培养箱中过夜（15 小时至 19 小时之间）。
   2. 第二天，测量OD₆₀₀ nm，并在玻璃管中的新鲜温度调节培养基（37°C，MOPS甘油0.4%）中稀释培养物至最终OD₆₀₀ nm~0.001。让培养物在37°C和180rpm的摇动培养箱中生长过夜（15小时至19小时之间），以在第二天获得早期指数期培养物。
2. 微流控板的制备和延时显微镜成像
   注意： 微流控实验可以在市售的微流控设备（如此处所述）或内部生产的微流控系统中进行。
   1. 从微流控板的每个孔中取出保存溶液（如果存在），并用新鲜培养基替换。
      注意： 如果微流控板含有废液出口孔，则应去除出口孔的保护液，但不要用介质代替。
   2. 通过单击 “密封” 按钮或通过微流控软件（首先选择 “工具”，然后选择“ 密封板”），用歧管系统密封微流控板。
      注意： 为了密封板，应通过手动将板挤压在歧管上，对板和歧管施加均匀的压力。如果执行正确，ONIX2 界面上应出现“密封”注释。重要的是不要对载玻片施加任何压力，以避免任何破坏歧管的潜在风险。
   3. 密封后，执行第一个启动序列（单击微流体软件界面上的 运行液体启动序列 ）。
      注意：运行液体启动序列 对应于孔 1-5 在 6.9 kPa 下灌注 5 分钟，然后对孔 8 在 6.9 kPa 下灌注 5 分钟，以及在 6.9 kPa 下对孔 6 进行 5 分钟的最后灌注。 运行液体灌注序列 允许去除连接不同孔的通道中可能仍存在的保护溶液。
   4. 在显微镜成像开始前，将板在显微镜的恒温控制柜中以所需温度（此处为37°C）孵育至少2小时。
   5. 在开始实验之前，开始第二个 运行液体启动序列 。
   6. 通过单击微流控软件界面上的密封来密封微流控板。用 200 μL 新鲜培养基替换孔 1 和孔 2 中的培养基，在孔 3 中用 200 μL 含有抗生素的新鲜培养基（此处为氧氟沙星 （OFX）为 5 μg·mL⁻¹）替换，在孔 4 和孔 5 中用 200 μL 新鲜培养基替换，在孔 6 中用 200 μL 新鲜培养基， 在孔 8 中，在新鲜培养基中将 200 μL 培养样品（来自步骤 1.2）稀释至 OD₆₀₀ nm 0.01。
   7. 按照 步骤 2.2 中的说明密封微流控板，并将其放在显微镜柜内的显微镜物镜上。
      注意： 在放置微流控板之前，确保在显微镜物镜上滴一滴浸油。
   8. 在微流控软件中，单击 “细胞加载” 以允许将细胞加载到微流控板中。
      注意： 细胞加载步骤包括对8孔进行13.8 kPa灌注15秒，然后对6孔和8孔进行15 s以27.6 kPa灌注，以及对6号孔进行30 s的最后灌注，6.9 kPa。微流控板中细胞的密度对于实验至关重要。该微流体方案的第一部分包括在抗生素处理前在新鲜培养基中培养细菌6小时。生长6小时后，细胞密度必须足以检测罕见的持久性细胞（在本研究中使用的条件下，持久性细胞以10⁻⁴的频率产生）。如果细胞密度过高，则很难区分单个细胞，从而无法进行精确的单细胞分析。由于生长速率直接取决于培养基，因此在开始实验之前应评估显微镜区域中细胞的密度。
   9. 使用透射光模式设置最佳焦点，并选择观察到适当细胞数的几个感兴趣区域 （ROI）（每个区域最多 300 个细胞）。
      注意： 选择至少 40 个 ROI 以确保对稀有持久性细胞进行成像。
   10. 在微流体软件上，单击 创建方案。对以 6.9 kPa 注射新鲜培养基 6 小时（孔 1-2）进行编程，然后以 6.9 kPa 注射含有抗生素的培养基 6 小时（孔 3），最后以 6.9 kPa 注射新鲜培养基 20 小时（孔 4-5）。
       注意： 稀释至OD₆₀₀ nm 0.01的细菌培养物允许细菌在微流体室中生长6小时，确保细胞处于指数生长阶段。根据在加载步骤（参见步骤2.8）期间引入微流控装置的细胞数量，可以调整生长阶段的持续时间，以获得每个ROI多达300个细胞。由于持久性是一种罕见的现象，因此增加每个 ROI 的细胞数量可以提高观察持久性细胞的可能性。但是，每个 ROI 的细胞数量不应超过 300 个细胞，因为这会使单细胞分析变得乏味。
   11. 使用透射光和荧光报告基因的激发光源，以延时模式每 15 分钟一帧进行显微镜成像。在这里，使用了 560 nm 激发光源来接收 mCherry 信号（580 nm LED，功率为 10%，滤光片 00 [530-585 ex，615LP em，蔡司]，mCherry 为 100 ms 曝光）。与蔡司兼容的Zen3.2软件用于细胞成像。
3. 图像分析
   注意： 显微镜图像的打开和可视化是使用开源的 ImageJ/Fiji 软件 （https://fiji.sc/） 进行的。使用开源 ImageJ/Fiji 软件和免费的 MicrobeJ 插件 （https://microbej.com） 进行定量图像分析。在该协议中，使用了MicrobeJ 5.13I（14）版本。
   1. 在计算机上打开ImageJ / Fiji软件，将超堆栈延时显微镜图像拖到Fiji加载栏中。使用 “图像>颜色”>“合成” 来融合超堆栈的不同通道。如果延时实验的通道与所需的颜色不对应（例如，相位对比度显示为红色而不是灰色），请使用 图像>颜色>排列通道 将适当的颜色应用于通道。
   2. 打开MicrobeJ插件，使用手动编辑界面检测细菌细胞。删除自动检测到的单元格，并逐帧手动勾勒出感兴趣的持久性单元格。
      注意： 可以使用不同的设置来自动检测单个细胞。这里使用手动检测，因为分析的持久性细胞形成长丝，很少使用自动检测正确检测到这些细丝。
   3. 检测后，使用MicrobeJ手动编辑界面中的 Result 图标生成ResultJ表。保存 ResultJ 文件并使用它来深入了解单细胞分析中感兴趣的不同参数。在该协议中，导出了胡-mCherry强度，细胞长度和单个细胞的细胞面积的平均荧光。

Materials