利用表达荧光报告蛋白的细菌筛选环二鸟苷酸单磷酸调节剂

摘要

来源： Rugjee, K. N., 等建立高通量筛选体系用于发现调控c-di-GMP信号通路的小分子 铜绿假单胞菌. 视频实验杂志 (2016).

本视频演示了使用经基因改造的细菌筛选环二鸟苷单磷酸（c-di-GMP）调节剂的方法，该细菌在c-di-GMP敏感型启动子调控下表达绿色荧光蛋白（GFP）。在含有不同待测化合物的多孔板中检测荧光信号。能够抑制c-di-GMP生成的化合物会导致荧光减弱。随后分析数据，以鉴定可能影响细菌c-di-GMP信号通路的调节剂。

方案

1. 生成绿色荧光蛋白（GFP）标记的环二鸟苷酸（c-di-GMP）报告系统 铜绿假单胞菌 菌株

1. 取一单菌落的P. aeruginosa接种于5 ml溶菌肉汤（LB）培养基中，37 °C、200 rpm振荡培养过夜。
2. 将过夜培养物2 ml转移至1 L锥形瓶中的200 ml新鲜LB培养基中，37 °C、200 rpm振荡培养。
3. 每隔30分钟取1 ml培养液，用分光光度计测定其在600 nm处的光密度（OD₆₀₀）。
4. 当OD₆₀₀达到0.3–0.5时，取40 ml培养物转入50 ml锥形离心管中。
5. 在4 °C条件下以8,000 rpm离心10分钟收集菌体，弃上清，将菌体重悬于40 ml预冷的无菌300 mM蔗糖溶液中。
6. 再次按照步骤1.5所述条件离心收集菌体，并将菌体重悬于20 ml预冷的无菌300 mM蔗糖溶液中。
7. 最后一次按照步骤1.5所述条件离心收集菌体，并将菌体重悬于400 µl预冷的无菌300 mM蔗糖溶液中。
   注意：此时菌液浓度应约为1 × 10¹¹ 菌落形成单位每毫升（CFU/ml）。
8. 将菌体置于冰上冷却30分钟，随后即可用于电穿孔转化。
9. 在预冷的1.5 ml微量离心管中加入40 µl上述制备的P. aeruginosa电转化感受态细胞，再加入1 µl浓度为0.2 µg/µl的pCdrA::gfp^C质粒溶液，混匀后转移至预先冷却的、电极间隙为2 mm的电穿孔比色皿中。
10. 用纸巾擦干比色皿外壁的水分，将比色皿放入电穿孔仪样品室，设置电压2.5 kV、电容25 µF、电阻200 Ω进行电击。
11. 取出比色皿后加入1 ml LB培养基，将菌液转移至无菌的1.5 ml微量离心管中，37 °C、200 rpm振荡培养2小时。
12. 分别取10 µl、50 µl和100 µl培养液涂布于添加氨苄青霉素（终浓度100 µg/ml）的无菌LB琼脂平板上，37 °C过夜培养。
13. 使用标准GFP通道在荧光显微镜下观察平板，确认GFP表达（激发波长485 nm，发射波长520 nm），挑取单菌落接种于5 ml LB培养基中，按步骤1.1所述条件过夜培养。取0.5 ml过夜培养物与0.5 ml 50%甘油混合于2 ml螺口管中，保存于-80 °C。

2. 接种用 starter culture 的制备

1. 实验前两天，用无菌接种环将含有 pCdrA::gfp^C 质粒的 P. aeruginosa 菌株从 -80 °C 保存液中转接至 LB 琼脂平板（添加 100 µg/ml 氨苄青霉素），并在平板表面均匀涂布。于 37 °C 培养过夜。
2. 筛选前一天晚上，从平板上挑取单个 P. aeruginosa 菌落，接种于含有 100 µg/ml 氨苄青霉素的 10 ml LB 液体培养基中，置于试管内，于 37 °C、200 rpm 振荡条件下过夜培养，获得预培养物。
3. 筛选当天，将过夜预培养物用新鲜 LB 培养基稀释至 OD₆₀₀ 为 1.0，再用 5% LB 培养基进一步稀释至 OD₆₀₀ 为 0.04（稀释比例 1:25），制备二级培养物。
   注意：接种培养基的总体积取决于待测平板的数量。5% LB 培养基通过将 100% LB 用磷酸盐缓冲液（PBS）稀释至所需浓度制备而成。重要的是，该培养基（5% LB）可使 P. aeruginosa 中的 pCdrA::gfp^C 持续激活。
4. 向容器中加入无菌磁力搅拌子，在室温下将菌液置于磁力搅拌器上以最低速度搅拌 30 分钟，使细菌在分装至 384 孔板前适应培养基环境。

3. 小分子384孔板的接种与培养

注意：无菌操作和良好的无菌技术对以下步骤至关重要。

1. 制备阳性对照（100% 抑制）时，向步骤 2.3 中制备的 10 ml 菌液（足够用于最多 12 块板）中加入 20 µl 妥布霉素硫酸盐（25 mg/ml），轻轻混匀。用移液器将 40 µl 阳性对照菌液加入 A23-P23 孔中（图 1）。
2. 制备阴性对照（0% 抑制）时，向步骤 2.3 中制备的 10 ml 菌液（足够用于最多 12 块板）中加入 30 µl 二甲基亚砜（DMSO），轻轻混匀。用移液器将 40 µl 阴性对照菌液加入 A24-P24 孔中（图 1）。
3. 对于每一块点样有小分子的板，将步骤 2.3 中所述的稀释过夜培养物各 40 µl 接种至 A1-P22 孔中（图 1）。
   注意：此步骤可使用液体处理机器人完成。由于细菌培养物具有异质性，分液过程中必须持续进行适度振荡，以确保细菌在培养基中均匀分布。为此，在分液期间应使用磁力搅拌器持续搅拌步骤 2.4 中已适应温度的菌液。
4. 用透气封板膜密封培养板，并在 37 °C 下孵育 6 小时。
   注意：使用透气封板膜对于维持全部 384 个孔内环境的一致性至关重要，可避免板内出现氧气梯度。

4. 生长（OD600）和胞内 c-di-GMP 水平（GFP）的测定

1. 在进行分光光度测量前约30分钟，将酶标仪预热至37 °C，以避免产生冷凝水。
2. 读数前轻轻取下透气性盖膜。设置每孔10次闪光、稳定时间为0.2秒，于波长600 nm处测定光密度。
3. 在测量荧光之前，基于A24孔（阴性对照）进行自动增益和焦点调整，并将增益目标值设为75%（图1）。
   1. 在酶标仪控制软件中，点击“开始测量”，然后点击“焦点与增益调整/板编号”选项卡。
   2. 在窗口右侧选择“焦点调整”和“通道A”。
   3. 选择“增益调整”和“选定孔”，在“目标值”栏中输入“75”。最后，在点击“开始调整”前，在板布局中选择A24孔。调整完成后，点击“开始测量”。
   4. 使用每孔10次闪光、稳定时间0.2秒的设置，在激发/发射最大值为485/520 nm的条件下测定GFP报告基因的荧光强度。
4. 收集所有检测板的数据。
   注意：酶标仪控制软件会自动将数据读数以默认方式保存。
   1. 在控制软件中点击“Mars”图标，打开统计分析包以查看读数。
   2. 通过双击感兴趣的板编号，调取相应数据进行分析。

结果

图1. 小分子筛选实验所用的384孔板布局图。 文库中的化合物（浅蓝色）被分装至A1-P22列的孔中。“阳性对照”（红色），即终浓度为50 µg/ml的妥布霉素硫酸盐，加入至A23-P23列的孔中；“阴性对照”（绿色），即终浓度为1%的DMSO，加入至A24-P24列的孔中。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
溶菌肉汤（Lennox）	Sigma Aldrich	L3022-1KG
蔗糖	Sigma Aldrich	S0389-1KG
含琼脂的溶菌肉汤（Lennox）	Sigma Aldrich	L2897-1KG
氨苄青霉素钠	Sigma Aldrich	A0166-25G
甘油	Sigma Aldrich	G5516-1L
磷酸盐缓冲液，pH 7.4	Life technologies	10010-056
妥布霉素硫酸盐	Sigma Aldrich	T1783-100MG
二甲基亚砜（DMSO）	Sigma Aldrich	276855-250ML
Genesys 10S 紫外-可见分光光度计	Thermoscientific	840-208100
2 mm 间隙电穿孔比色皿	Bio-Rad	1652092
BioRad GenePulser XCell 电穿孔仪	Bio-Rad	1652662
Leica 荧光体视显微镜	Leica Microsystems	MZ16FA
BRAND 磁力搅拌子，PTFE 材质，圆柱形带枢轴环（使用前需高压灭菌）	Sigma Aldrich	Z328952-10EA
384 孔，白色孔壁，透明底板	Greiner	781098
Multidrop Combi 试剂分配器	Thermo Scientific	5840300
Multidrop Combi 管路	Thermo Scientific	24073290
VIAFLO II 16 通道电子移液器	Integra Biosciences	4642
100 ml 无菌一次性试剂储液槽	Fisher Scientific	12399175
AeraSeal 透气膜	Sigma Aldrich	MKBQ1886
Pherastar 酶标仪（软件版本：4.00 R4，固件版本：1.13）	BMG Labtech	Pherastar FS