使用表达荧光报告蛋白的细菌筛选环状 di-GMP 调节剂

Abstract

资料来源： Rugjee， K. N. 等人。建立一种高通量装置，用于筛选在 铜绿假单胞菌中调节c-di-GMP信号传导的小分子。 J. Vis. Exp. （2016）。

该视频演示了在c-di-GMP敏感启动子的控制下，使用表达绿色荧光蛋白（GFP）的转基因细菌筛选环状di-GMP调节剂。荧光是在含有不同测试化合物的多孔板中测量的。抑制 c-di-GMP 产生的化合物会导致荧光降低。然后分析数据以确定细菌中c-di-GMP信号传导的潜在调节剂。

Protocol

1. 绿色荧光蛋白（GFP）标记的环状di-GMP（c-di-GMP）报告基因铜绿假单胞菌菌株的生成

1. 用单个铜 绿假单胞 菌菌落接种 5 ml 溶原性肉汤 （LB） 培养基，并在 37°C 下以 200 rpm 摇动孵育过夜。
2. 将 2 ml 过夜培养物转移到 1 L 烧瓶中的 200 ml 新鲜 LB 培养基中，并在 37 °C 下以 200 rpm 振荡孵育。
3. 每 30 分钟监测一次 600 nm （OD₆₀₀） 的光密度，方法是从烧瓶中取出 1 ml 样品并使用分光光度计进行检查。
4. 当OD₆₀₀ 达到0.3-0.5之间时，将40ml培养物放入50ml锥形离心管中。
5. 通过在4°C下以8,000rpm离心10分钟来沉淀细胞，弃去上清液，并将细胞重悬于40ml冰冷的无菌300mM蔗糖溶液中。
6. 如步骤1.5所述，通过离心第二次沉淀细胞，并重悬于20ml冰冷的无菌300mM蔗糖溶液中。
7. 按照步骤1.5中所述，通过离心最后一次沉淀细胞，并重悬于400μl冰冷，无菌的300mM蔗糖溶液中。
   注意：此时的细胞密度应约为每毫升 1 x^{10 11} 个菌落形成单位 （CFU/ml）。
8. 将细胞在冰上冷却30分钟，然后它们就可以进行电穿孔了。
9. 将 1 μl 0.2 μg/μl pCdrA：：gfp^C 质粒溶液加入上述 40 μl 铜绿假单胞菌 电感受态细胞中，该细胞在已在冰上预冷的 1.5 ml 微量离心管中制备。混合悬浮液并将其转移到预冷的 2 mm 电极间隙电穿孔比色皿中。
10. 用薄纸去除比色皿外部的水分，然后将比色皿放入电穿孔器的样品室中。脉冲电压为 2.5 kV，电容为 25 μF，电阻为 200 Ω。
11. 取出比色皿并加入 1 ml LB 培养基。然后，将细胞转移到无菌的1.5ml微量离心管中，并在37°C下以200rpm摇动孵育2小时。
12. 将培养物的 10 μl、50 μl 和 100 μl 等分试样铺展到补充有氨苄青霉素（浓度为 100 μg/ml）的无菌 LB 琼脂平板上，并将平板在 37 °C 下孵育过夜。
13. 通过在具有标准GFP通道的荧光显微镜下检查板来确认GFP表达（485nm激发，520nm发射），并挑选单个菌落接种5mL LB。如步骤1.1所述孵育过夜。将 0.5 ml 过夜培养物与 0.5 ml 50% 甘油混合在 2 ml 螺旋顶管中，并储存在 -80 °C 下。

2. 接种用发酵剂培养物的制备

1. 筛选前两天，将 铜绿假单胞菌 菌株（含有pCdrA：：gfp^C 质粒）从-80°C储备液接种到LB-琼脂平板（补充浓度为100μg/ml的氨苄青霉素）上，方法是使用无菌接种环轻轻地将细菌铺在板上。将板在37°C下孵育过夜。
2. 筛选前一天晚上，将板中的单个铜 绿假单胞 菌菌落接种到管中的10ml LB培养基（补充浓度为100μg/ ml的氨苄青霉素）中，并将预培养物在37°C下孵育过夜，以200rpm摇动。
3. 在筛选当天，从过夜预培养中制备传代培养物，首先用新鲜的LB培养基将其稀释至OD₆₀₀ 1.0，然后用5% LB进一步稀释至OD₆₀₀ 0.04（1：25比例）。
   注意：接种培养基的总体积取决于要测试的板数。5% LB 是通过用磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 将 100% LB 稀释至所需浓度来制备的。重要的是，培养基 （5% LB） 允许铜绿假单胞菌中的 pCdrA：：gfp^C 的组成型激活。
4. 将无菌磁力搅拌棒加入容器中，并在室温下在磁力搅拌器上以最小速度搅拌培养物30分钟，使细菌在分配到384孔板之前适应培养基。

3. 含有小分子的 384 孔板的接种和孵育

注意：无菌和良好的无菌技术对于以下步骤至关重要。

1. 要制备阳性对照（100%抑制），请将20μl硫酸妥布霉素（25mg / ml）加入步骤2.3中制备的传代培养物的10ml（最多12个板），并轻轻混合。将 40 μl 阳性对照培养物移液到孔 A23-P23 中（图 1）。
2. 要制备阴性对照（0% 抑制），请将 30 μl 二甲基亚砜 （DMSO） 添加到步骤 2.3 中制备的传代培养物的 10 ml（最多 12 个板）中并轻轻混合。将 40 μl 阴性对照培养物移液到孔 A24-P24 中（图 1）。
3. 对于每个印有小分子的板，将体积的 40 μl 稀释的过夜培养物（在步骤 2.3 中描述）接种到孔 A1-P22 中（图 1）。
   注意：这可以使用液体处理器机器人来实现。由于细菌培养物的异质性，保持连续和适度的搅拌非常重要，以在分配时保持细菌在培养基中的一致分布。为此，请在分配过程中继续磁性搅拌步骤 2.4 中的驯化培养物。
4. 用透气盖密封密封板，并在 37 °C 下孵育 6 小时。
   注意：透气密封对于保持所有 384 孔的不变条件和规避整个板上氧梯度的潜在发展至关重要。

4. 生长 （OD600） 和细胞内 c-di-GMP 水平 （GFP） 的测量

1. 分光光度测量前约30分钟，将酶标仪预热至37°C，以避免冷凝。
2. 阅读前轻轻取下透气盖封。测量波长为 600 nm 的光密度，设置为每孔 10 次闪烁，建立时间为 0.2 秒。
3. 在测量荧光之前，根据孔 A24（阴性对照）进行自动增益和焦点调整，并将增益目标值设置为 75%（图 1）。
   1. 在读板器控制软件中，单击开始测量，然后单击“焦点和增益调整/印版 ID”选项卡。
   2. 选择窗口右侧的“对焦调整”和“通道 A”。
   3. 选择“增益调整”和“选择井”，然后输入“75”作为“目标值”。最后，在板布局中选择井 A24，然后单击“开始调整”。调整完成后，单击“开始测量”。
   4. 在 485/520 nm 的最大激发/发射下测量 GFP 报告基因的荧光，设置为每孔 10 次闪光，沉降时间为 0.2 秒。
4. 从所有检查的板中收集数据。
   注意：读板器控制软件会自动将数据读数保存为默认值。
   1. 通过单击控制软件中的“火星”图标打开统计分析包来查看读数。
   2. 通过“双击”感兴趣的车牌号来检索数据，以访问数据进行分析。

Results

图 1.用于小分子筛选测定的 384 孔板图。 将来自文库的化合物（浅蓝色）等分到孔 A1-P22 中。将最终浓度为50μg/ml硫酸妥布霉素的“阳性对照”（红色）添加到孔A23-P23中，将含有终浓度为1%DMSO的“阴性对照”（绿色）添加到孔A24-P24中。

Materials