制备单克隆细菌培养物的技术

摘要

来源：Lin, P., 等．通过细菌矿物排泄法合成钨酸钠和钼酸钠微胶囊．J. Vis. Exp. （2018）

本视频演示了通过连续稀释法及在琼脂平板上进行菌落分离，制备用于矿物生成的单克隆细菌培养物。通过使用玻璃珠振荡平板，使单个细胞在空间上分离，形成基因一致的菌落，随后将这些菌落转移至液体培养基中进行扩增。选择浊度最高的培养物，表明其具有最密集的单克隆菌群，因而具备最大的矿物生成潜力。

方案

1. 玻璃珠的准备

1. 将100个直径为3 mm的玻璃珠放入一个100 mL的实验室瓶中，然后 tightly 封盖。
2. 在120 °C下高压灭菌10分钟。
3. 让瓶子冷却至室温，然后将其放入生物安全柜中。

2. 营养肉汤（LB）的制备

1. 在500 mL的实验室瓶中，将8 g LB-Lennox肉汤粉末溶于400 mL水中。
2. 使用聚四氟乙烯（PTFE）磁力搅拌子搅拌20分钟，然后 tightly 封口。
3. 在120 °C条件下高压灭菌10分钟。
4. 让溶液冷却至室温，并置于生物安全柜中。
5. 在生物安全柜中，使用移液器将肉汤分装至八个15 mL离心管中（每管12.5 mL）。
6. 在生物安全柜中，将剩余肉汤分装至三个100 mL实验室瓶中（每瓶100 mL），紧密封口，并保留在生物安全柜中。

3. 培养 Shewanella algae

1. 使用深冻保存的冷冻菌株。
2. 在生物安全柜中，用不锈钢刮勺从冷冻管中取出1 mL冻存物，并转移至步骤3.5中已准备好的离心管中。
3. 将培养物置于37 °C培养箱中培养24小时。

4. LB-Lennox（含琼脂的肉汤）培养皿的制备

1. 将两片LB-Lennox（含琼脂的肉汤培养基）溶解于装有100 mL水的100 mL实验室瓶中。
2. 使用聚四氟乙烯（PTFE）磁力搅拌子搅拌溶液20分钟，然后 tightly 封盖。
3. 在120 °C条件下高压灭菌10分钟。
4. 在生物安全柜中，手动将100 mL溶液分装至4个培养皿中，确保每个培养皿约加入25 mL。静置溶液，使其冷却至室温。

单克隆细菌的制备

1. 在生物安全柜中，将步骤 2.6 中准备的三个瓶子分别标记为 #1、#2 和 #3。
2. 用移液器吸取步骤 3.3 中获得的细菌悬液 0.1 mL，加入瓶子 #1 中。盖紧瓶盖，手动摇动 1 分钟，使溶液混匀。
3. 用移液器吸取步骤 5.2 中获得的细菌液体 0.1 mL，加入瓶子 #2 中。盖紧瓶盖，手动摇动 1 分钟，使溶液混匀。
4. 用移液器吸取步骤 5.3 中获得的细菌液体 0.1 mL，加入瓶子 #3 中。盖紧瓶盖，手动振荡 1 分钟，使溶液混匀。
5. 用移液器将瓶子 #3 中的液体分别加入步骤 4.4 中准备的 4 个培养皿中，每个培养皿加入 0.02 mL。
6. 将步骤 1.3 中准备的玻璃珠放入上述 4 个培养皿中，每个培养皿放入 4 颗。
7. 盖上培养皿盖子，手动摇动 1 分钟。
8. 将培养皿倒置，放入 37 °C 培养箱中培养 24 小时。

6. 单克隆细菌的扩增

1. 取步骤2.5中准备的7个试管。
2. 用不锈钢刮勺从步骤5.8中准备的4个培养皿中挑取得到的单克隆菌落，并分别放入7个试管中。
3. 将7个试管置于37 °C培养箱中培养24小时。
4. 采用目视比色法，选出光散射最强的一个。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
含琼脂片的LB（Lennox肉汤）	Sigma-Aldrich	L7075	每50 mL肉汤加1片琼脂片
LB（Lennox肉汤）	Sigma-Aldrich	L3022-1KG	LB（Lennox）粉末，1 kg
无水葡萄糖	Nihon Shiyaku Reagent	PL 78695	葡萄糖
50 mL 离心管	Falcon	14-432-22
15 mL 离心管	Falcon	14-959-53A
100 mL 实验室瓶	Duran	21 801 24 5
500 mL 实验室瓶	Duran	21 801 44 5
不锈钢刮勺	Chemglass	CG-1981-10
聚四氟乙烯一次性搅拌子	Fisher	S68066
塑料培养皿	Fisher	S33580A
培养箱	定制	custom made	可加热至40 °C或冷却至18 °C，并具有时间控制功能
生物安全柜	宗延有限公司	ZYBH-420	所有与细菌相关的操作均在此进行
高压灭菌器	Tomin Medical Equipment co., Ltd., 中国台湾台北市	TM-329	120 °C加热10分钟