利用金属还原细菌合成金属氧化物微胶囊

摘要

来源：Lin, P., 等. 通过细菌矿物排泄法合成钨酸钠和钼酸钠微胶囊. J. Vis. Exp. (2018).

本视频演示了通过培养金属还原细菌与金属离子，随后经超声处理、离心和乙醇洗涤等逐步纯化步骤，合成刚性金属氧化物微胶囊的实验流程。

方案

注意：进行实验时需佩戴乳胶手套、防护眼镜并穿上实验服。使用生物安全柜时，应开启柜内风扇，并将柜门保持半开状态。

1. 玻璃珠的制备

1. 将100颗直径为3 mm的玻璃珠放入一个100 mL的实验室瓶中，然后 tightly 封盖。
2. 在120 °C下高压灭菌10分钟。
3. 让瓶子冷却至室温，然后将其放入生物安全柜中。

2. 溶菌肉汤（LB）的制备

1. 在500 mL的实验室瓶中，将8 g LB-Lennox肉汤粉末溶于400 mL水中。
2. 使用聚四氟乙烯（PTFE）磁力搅拌子搅拌20分钟，然后 tightly 封口。
3. 在120 °C条件下高压灭菌10分钟。
4. 让溶液冷却至室温，并置于生物安全柜中。
5. 在生物安全柜中，使用移液器将肉汤分装至八个15 mL离心管中（每管12.5 mL）。
6. 在生物安全柜中，将剩余肉汤分装至三个100 mL实验室瓶中（每瓶100 mL）。紧密封口，并保存在生物安全柜中。

3. Shewanella algae 的培养

1. 使用深冻保存的冷冻菌株。
2. 在生物安全柜中，用不锈钢刮勺从冷冻管中取出1 mL冻存物，放入步骤3.5中已准备好的离心管中。
3. 将培养物置于37 °C培养箱中培养24小时。

4. LB-Lennox（含琼脂的肉汤）培养皿的制备

1. 将两片LB-Lennox（含琼脂的肉汤培养基）溶解于装有100 mL水的100 mL实验室瓶中。
2. 使用聚四氟乙烯（PTFE）磁力搅拌子搅拌溶液20分钟，然后盖紧瓶盖。
3. 在120 °C条件下高压灭菌10分钟。
4. 在生物安全柜中，手动将100 mL溶液分装至4个培养皿中，确保每个培养皿约加入25 mL。静置溶液，使其冷却至室温。

5. 单克隆细菌的制备

1. 在生物安全柜中，将步骤 2.6 中准备的三个瓶子分别标记为 #1、#2 和 #3。
2. 用移液器吸取步骤 3.3 中获得的细菌悬液 0.1 mL，加入瓶子 #1 中。盖紧瓶盖，手动摇动 1 分钟，使溶液混匀。
3. 用移液器吸取步骤 5.2 中获得的细菌液体 0.1 mL，加入瓶子 #2 中。盖紧瓶盖，手动摇动 1 分钟，使溶液混匀。
4. 用移液器吸取步骤 5.3 中获得的细菌液体 0.1 mL，加入瓶子 #3 中。盖紧瓶盖，手动振荡 1 分钟，使溶液混匀。
5. 将瓶子 #3 中的液体用移液器分别加入步骤 4.4 中准备的 4 个培养皿中，每个培养皿加入 0.02 mL。
6. 将步骤 1.3 中准备的玻璃珠放入上述 4 个培养皿中，每个培养皿放入 4 颗。
7. 盖上培养皿盖子，手动摇动 1 分钟。
8. 将培养皿倒置，放入 37 °C 培养箱中培养 24 小时。

6. 单克隆细菌的扩增

1. 取步骤2.5中准备的7个试管。
2. 用不锈钢刮铲从步骤5.8中准备的4个培养皿中挑取得到的单克隆细菌，并分别放入7个试管中。
3. 将7个试管置于37 °C培养箱中培养24小时。
4. 采用目视比色法，挑选出光散射最强的一个。

7. 含葡萄糖和盐的LB-Lennox肉汤的制备

1. 将10 g LB-Lennox肉汤、10 g NaCl和10 g葡萄糖加入一个500 mL的实验室瓶中。加水至总体积达到450 mL。
2. 使用聚四氟乙烯（PTFE）磁力搅拌子搅拌溶液20分钟。
3. 在120 °C条件下高压灭菌10分钟。

8. 钨酸钠的制备

1. 用不锈钢药匙将16.5 g钨酸钠 Na₂WO₄．2H₂O 置于100 mL的实验室瓶中。加水至总体积达到50 mL。
2. 使用聚四氟乙烯（PTFE）磁力搅拌子搅拌20分钟。
3. 在120 °C条件下高压灭菌10分钟。
4. 在生物安全柜中，使用孔径为1 µm的真空玻璃纤维滤膜过滤，收集滤液。

9. 含葡萄糖、盐和钨酸钠的LB培养基的制备

1. 在生物安全柜中，将步骤 8.4 中手工过滤所得的滤液倒入步骤 7.3 中配制的葡萄糖与盐溶液中。
2. 在生物安全柜中，用移液器将步骤 9.1 中得到的 500 mL 溶液分装至 10 个 50 mL 离心管中，每管 50 mL。

10. 细菌培养

1. 在生物安全柜中，取步骤 6.4 中制备的液体，用移液器将其分装至步骤 9.2 中准备的 10 支试管中，每管加入 0.05 mL。
2. 将 10 支试管置于 37 °C 培养箱中孵育 120 h。

11. BME 矿物质的收获

1. 将步骤9.2中的10个试管在20 kHz、150 W条件下超声处理1小时。
2. 以2,025 × g离心试管1小时。
3. 用移液器移除试管中的澄清液体，加入水，然后再次重复步骤11.1和11.2一次。
4. 用移液器移除试管中的澄清液体，加入酒精，然后在20 kHz、150 W条件下超声处理1小时。
5. 以2,025 × g离心试管1小时。
6. 再次重复步骤11.4和11.5一次。
7. 通过用移液器移除试管中的澄清液体来收获BME矿物；之后立即盖紧试管，不进行任何干燥过程。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
含琼脂片的LB（莱恩诺克斯）肉汤	Sigma-Aldrich	L7075	每50 mL肉汤加1片琼脂
LB（莱恩诺克斯）肉汤	Sigma-Aldrich	L3022-1KG	1 kg LB（莱恩诺克斯）粉末
无水葡萄糖	日本试剂	PL 78695	葡萄糖
钨酸钠	日本试剂	PL 76050	Na2WO4 · 2H2O
氯化钠	日本试剂	PL 68131	NaCl
99.5%乙醇	Acros organics	AC615090040	CH3CH2OH
水	本校制备		去离子水
高压灭菌器	Tomin Medical Equipmenco, Ltd., 台北市，中国台湾	TM-329	120 °C 加热10分钟
离心机	Digit System Laboratory System, 新北市，中国台湾	DSC302SD	2025 × g 离心
-80 °C 冰箱	松下	MDF-U3386S	用于深冻保存菌种
超声波均质器/超声破碎仪/细胞破碎仪	Lenox	UPS-150	频率20 KHz，功率150 W
培养箱	定制	custom made	可程序控制加热至40 °C或冷却至18 °C
往复式摇床	Kingtech Scientific Co., Ltd	WBS-L
数字式搅拌加热板	Corning	#6797-620D	配合PTFE磁力搅拌子使用
生物安全柜	宗延有限公司	ZYBH-420	所有与细菌相关的操作均在此进行
50 mL 离心管	Falcon	14-432-22
15 mL 离心管	Falcon	14-959-53A
100 mL 实验室瓶	Duran	21 801 24 5
500 mL 实验室瓶	Duran	21 801 44 5
不锈钢刮勺	Chemglass	CG-1981-10
PTFE一次性搅拌子	Fisher	S68066
塑料培养皿	Fisher	S33580A
Shewanella algae	由作者#3提供	由作者#3提供