评估有益细菌对热应激大鼠肠道微生物易位的影响

摘要

来源：Sorokulova, I.，等。利用Bacillus subtilis菌株预防热应激对大鼠的不良影响。J. Vis. Exp. (2016)

本视频展示了经有益细菌或磷酸盐缓冲盐水（PBS）预处理的大鼠在暴露于热应激后，用于评估肠道屏障完整性的实验。与对照组大鼠肝脏中出现大量来源于肠道的细菌菌落相比，处理组大鼠肝脏中此类菌落数量显著减少，表明其肠上皮屏障保持完整，细菌易位程度极低。

方案

所有涉及动物模型的实验程序均已通过当地机构动物护理委员会和 JoVE 动物医学评审委员会的审核。

1. 实验设计

1. 动物适应环境2天后，开始通过口服灌胃进行处理。使用带有口服灌胃针头的注射器。用Bacillus subtilis BSB3菌液（每只大鼠1 ml）对16只大鼠进行处理，每天两次，连续两天（B. subtilis组）。另取16只大鼠，用磷酸盐缓冲液（PBS，每只大鼠1 ml）进行处理，每天两次，连续两天（PBS组）（图1）。
2. 处理结束后，将每组再分为四个亚组（每组8只大鼠）：第1组-对照组（PBS/无应激）、第2组-B. subtilis组（B. subtilis/无应激）、第3组-应激组（PBS/热应激）和第4组-B. subtilis+应激组（B. subtilis/热应激）。
3. 使用电子数字体温计测量每只大鼠的直肠温度。将第1组和第2组大鼠置于室温下25分钟。将第3组和第4组动物放入温度为45 °C、相对湿度为55%的气候箱中，持续25分钟。
4. 之后，使用电子数字体温计测量所有组别每只大鼠的直肠温度。随后将所有动物置于室温下静置4小时。
5. 在可密封的麻醉罐中使用异氟烷（2–4%）对大鼠进行麻醉，观察直至大鼠深度麻醉（对脚趾夹捏无反应）。采用断头器快速断头处死大鼠。
6. 使用无热原移液管从每只大鼠采集躯干血（15–16 ml），收集至无热原试管中以获取血清；同时立即用移液器取全血样本（每只大鼠7 µl）用于显微镜检查。
7. 将装有血液的试管置于冰箱中至少30分钟，以促进凝固。在20 °C下以7,000 × g离心10分钟，迅速用移液器吸取血清。将每只大鼠获得的血清分装为每份50 µl，储存于-20 °C直至检测使用。

2. 手术步骤

1. 使用电动剪刀剪除尸体腹侧腹部和胸部的所有毛发。将尸体放入无菌操作台中，并用70%酒精处理去毛后的表面。
2. 使用无菌解剖刀在腹部做正中切口。用无菌镊子从小鼠体内取出肝脏、肠系膜淋巴结、脾脏和小肠。

细菌移位的分析

1. 将每份肝脏、肠系膜淋巴结和脾脏样品分别放入预先称重的无菌试管中并称重。样品重量通过带样品试管的重量减去空试管的重量计算得出。
2. 向试管中加入无菌 PBS，使样品制成 1:10（重量/体积，w/v）的稀释液，并使用无菌玻璃组织匀浆器对每份样品进行匀浆，以获得均匀的悬浮液。
3. 用无菌 PBS 对每份样品进行连续稀释（10^-1 至 10^-4）。取每种组织各稀释度 0.1 ml，分别涂布于麦康凯琼脂、5% 血琼脂以及含血红素（0.005 g/L）和维生素 K1（0.01 g/L）的布氏血琼脂平板表面。
4. 将麦康凯琼脂平板和 5% 血琼脂平板在需氧条件下、布氏血琼脂平板在厌氧条件下，于 37 ^oC 培养。
5. 培养 24 小时后计数需氧菌菌落，48 小时后计数厌氧菌菌落，使用菌落计数器进行计数。结果以每克组织中菌落形成单位（CFU）的数量表示。

结果

图1. 研究设计。 将两组大鼠（每组16只）通过灌胃分别给予Bacillus subtilis BSB3（B. subtilis组）或PBS（PBS组），每天两次。第3天时，每组再细分为每组8只大鼠。第3组和第4组的大鼠被置于45 °C环境中25...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
磷酸盐缓冲液（PBS）	Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯	P4417
乙醇	Pharmco产品公司，美国康涅狄格州布鲁克菲尔德	64-17-5
琼脂	VWR	97064-334
麦康凯琼脂平板	VWR	470180-742
5% 血琼脂平板	VWR	89405-024
含血红素和维生素K的布鲁氏菌血琼脂平板	VWR	89405-032
环境舱 6020-1	卡龙，俄亥俄州马里埃塔，美国	6020-1
离心	Beckman Coulter，印第安纳波利斯，印第安纳州，美国	Optima L-90K
菌落计数器	Fisher Scientific，匹兹堡，宾夕法尼亚州，美国	RE-3325
冷冻柜	Haier，美国纽约州布鲁克林	HCMO50LA
移液器	吉尔森，Pipetman，法国	P100, P200, P1000
培养皿（100 mm × 15 mm）	Fisher Scientific，匹兹堡，宾夕法尼亚州，美国	875713
SterilGard III Advance	美国缅因州桑福德巴克公司	SG403
组织匀浆器，Dounce	VWR	71000-518