Bacillus subtilis 芽孢的制备与基于气溶胶的沉积

摘要

来源： Fuchs, F. M., 等. 研究低压等离子体灭菌对存活率的不利影响 枯草芽孢杆菌 使用活细胞显微镜观察孢子。 视频实验杂志 (2017)

本视频展示了枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）芽孢的制备、纯化及基于气溶胶的沉积，以形成均匀的单层，从而支持后续应用，例如基于显微镜的芽孢萌发、活力或应激反应分析。

方案

1. Bacillus subtilis 芽孢的制备与纯化

1. 用于产孢，取相应菌株5 mL过夜培养物进行转移 B. subtilis 菌株，加入适当的抗生素，接种于200 mL双倍浓度的液体Schaeffer孢子形成培养基（每升含16 g营养肉汤、KCl（氯化钾）2 g、0.5 g MgSO₄）₄*7 H₂O（七水合硫酸镁），2 mL 1 M Ca(NO₃)₂₃)₂ （硝酸钙），2 mL 0.1 M MnCl₂₂ • 4 H₂O（四水合氯化锰），2 mL 1 mM FeSO₄₄ （硫酸亚铁），2 mL 50%（w/v）葡萄糖18）并在37 °C下充分通气培养72小时，或直至 > 95% 的培养物已形成孢子。以下菌株的孢子被使用： B. subtilis PY79（野生型） B. subtilis PY79ΔrecA::neo（缺乏DNA修复蛋白RecA） B. subtilis PY79 recA-yfp::cat（RecA 与黄色荧光蛋白 [YFP] 的融合蛋白）
2. 通过在50 mL离心管中以3,000 x g离心15分钟收集孢子，并使用无菌蒸馏水通过重复洗涤步骤（最多15次）纯化样品₂O，并通过相差显微镜检查纯度和萌发状态。确保孢子悬液由相位明亮的孢子组成（> 99%），且无营养细胞（杆状）、萌发的孢子（呈黑色/灰色）及细胞碎片；否则，后续显微镜实验可能受到干扰。持续洗涤样品，直至达到所需纯度。
3. 通过将50 µL的10倍系列稀释液涂布于LB（Luria-Bertani）琼脂平板上，测定孢子滴度（例如：取30 µL样品加入270 µL无菌水中，配制1:10稀释液；再从此稀释液中取30 µL加入270 µL H₂O中，进行下一步稀释）。₂O，依此类推）计算CFU（菌落形成单位），并将平板在37 °C下过夜培养。在CFU测定后，将样品调整至10⁹ 每毫升孢子数通过无菌水浓缩或稀释进行调整。

2. 气溶胶沉积的Bacillus subtilis孢子样品制备

注意：孢子的聚集和重叠可能导致处理过程中出现遮蔽效应，最终导致失活动力学数据失真。为尽量减少此问题，应采用气溶胶沉积技术制备孢子样品。简言之，使用电子定时器控制高精度双物质喷嘴，调节液体通量，同时与加压载气（此处为 N₂）的气流同步。利用氮气气流将注入的液体样品从喷嘴出口分散。

1. 将样品载体（用于存活动力学实验的灭菌显微镜载玻片，或用于荧光追踪DNA修复过程/共聚焦激光扫描显微镜（cLSM）观察的25 mm圆形盖玻片）放入电动气溶胶喷雾装置中，并与喷嘴对齐。所用孢子浓度应为所需最终浓度的100倍。
2. 将1 mL孢子培养物转移至喷嘴液体入口，在1.3 bar压力下启动喷雾过程，持续0.1 s。喷出的孢子悬液（1 × 10⁷）在载玻片表面形成一层薄膜，数秒内迅速干燥，形成均匀分布的单层孢子。将处理后的样品载体置于室温下的无菌容器中保存。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
双物质喷嘴（型号 970-8）	Schlick	14,404	230 V，50 Hz，D 4.484/8，0.8 mm 孔径
LB 培养基（Luria Bertani Medium）	Sigma Aldrich	70122-100G
管路接头	Festo	n/a	G 1/8
载玻片	VWR	48300-026
Attofluor 细胞培养腔室	Menzel, Fisher Ref.	3406816	直径 25 mm，圆形
七水合硫酸镁	Sigma Aldrich	13152
硝酸钙	Sigma Aldrich	202967
四水合氯化锰	Sigma Aldrich	244589
硫酸亚铁	AppliChem	13446-34-9
葡萄糖	Merck	215422
氯化钾	Sigma Aldrich	P9541-500G
营养肉汤（NB）	Merck	105443
LB 培养基（Luria-Bertani, LB）	Merck	110283
96 孔板	ThermoFisher	243656