细胞活力分析 Microcystis aeruginosa 使用流式细胞术

摘要

来源：Chapman, I. J., 等，利用流式细胞术优化分子探针以测定光合生物（Microcystis aeruginosa）的细胞死亡率。J. Vis. Exp. (2016)

本视频演示了区分活细胞与死细胞的方法 Microcystis aeruginosa 通过荧光探针标记结合藻蓝蛋白自发荧光与探针信号的流式细胞术分析来检测细胞。

方案

1. 分子探针细胞摄取的优化

1. 从指数生长期收获一半的 M. aeruginosa 培养物，作为“活”对照。
   注意：将高密度培养物直接稀释至指数期的样本，与从初始迟滞期/诱导期接种的培养物相比，可能因死细胞周转而影响优化结果。
2. 通过以下方法将另一半制备为“死”对照：70% 乙醇处理、60 ^oC 加热 1 小时、多聚甲醛或 4% 甲醛处理 30 分钟。检查样本微环境（例如，pH）的变化。
   注意：M. aeruginosa 中阳性的、热灭活的“死”对照可通过其藻青蛋白信号的降低与“活”样本区分开来。采用其他方法诱导死亡可能不会产生相同的结果，且在不同物种中表现各异。
3. 使用不同比例的“活”和“死”样本（例如，0%、25%、50%、100%）制备混合样本。
4. 通过涡旋振荡或超声处理分散菌落结构，并检测 pH 值。
5. 选择 488 nm 激光器，并配备可记录绿色（荧光通道 1 或 FL1，530 ± 15 nm）和橙色（荧光通道 2 或 FL2，585 ± 20 nm）核酸探针荧光的检测器，同时使用 640 nm 激光器通过相应检测器记录藻青蛋白信号。
   注意：当与 DNA 结合时，绿色核酸探针的荧光激发波长约为 504 nm，发射峰值为 523 nm；橙色核酸探针的激发波长为 547 nm，发射峰值为 570 nm。可使用 488 nm 氩离子固态激光器激发两种分子探针，但绿色激光（最高至 547 nm）可产生更强的橙色荧光。
6. 以制造商推荐的浓度将分子探针加入 50%“活”和 50%“死”的培养物中，作为起始点，并在避光条件下孵育。
7. 选择一个新的数据单元，将样本置于样本引入口（SIP）下，设置阈值和触发条件以降低背景噪声（FSC-H 或前向散射高度，80,000）。
8. 创建一个以 FSC-H 和 SSC-H（侧向散射高度）为参数的密度图，以及三个直方图：一个使用相应的分子探针光学检测通道（FL1 或 FL2），一个用于检测藻青蛋白发射信号（荧光通道 4 高度或 FL4-H），另一个为 FSC-H，均采用对数刻度。
9. 将 M. aeruginosa 样本与核酸探针在避光条件下孵育最多 60 分钟，并在不同时间点（1、5、10、15、30 和 60 分钟）分别记录于独立的数据单元中。
   注意：在调节 pH 等参数时，需向制造商确认某些化学物质是否可能引发反应（对于测试的核酸探针，缓冲液不能含有磷酸盐或高浓度单价或二价阳离子，否则会降低与 DNA 的结合能力）。
10. 在目标生物细胞大小对应的荧光探针通道直方图中，应用软件门控仅包含 FSC-H 直方图范围（320,000 - 1,500,000）内的数据。
    注意：本方案中使用的浓度为 0.05、0.1、0.5、1、5、10、50 和 100 µM，可通过增加或减少 M. aeruginosa 样本体积或核酸探针初始储备液的体积进行调整。
11. 在荧光探针通道中，对直方图中的最高峰应用另一个包含性软件门控（绿色 FL1-H：240,000 - 1,650,000；橙色 FL2-H：30,000 - 165,000），随后将该阳性探针荧光信号门控至密度图中。
12. 对 100%“活”、100%“死”及所有混合培养样本重复执行步骤 3.1 至 3.11，必要时调整分子探针浓度（例如 ×0.1 至 ×10）和/或温度与 pH 水平。
13. 将阳性分子探针荧光信号的数量与“死”细胞的原始细胞密度（取自总 FSC-H 的一半或 100%“死”培养物）进行比较，以计算被核酸探针染色的细胞总百分比。
14. 对每个浓度下的各个时间段均进行上述分析，以确定在不产生非特异性染色的前提下，细胞核酸探针摄取率最高的最佳实验方案（若数据符合正态分布，采用单因素方差分析（ANOVA）的均值进行比较；若数据为非参数分布，则采用 Kruskal-Wallis 单因素方差分析）。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
蓝藻 培养基	Sigma-Aldrich	C3061-500ML	BG-11 淡水浓缩液（50倍稀释）
去污染液	BD Biosciences	653155	当快速模式下每秒输出事件数超过12个或流速达到66 µl/min时，运行2分钟。随后用鞘液水（H2O）冲洗2分钟。
流式细胞仪	BD Biosciences	by request	BD Accuri C6
SYTOX Green	Life Technologies	S7020	核酸染料——DMSO中5 mM溶液
SYTOX Orange	Life Technologies	S11368	核酸染料——DMSO中5 mM溶液