使用琼脂孔扩散法评估乳酸链球菌素变体的抗菌活性

摘要

来源：Nickling, J. H., 等. 通过选择性压力掺入非常规氨基酸产生的抗菌肽。 J. Vis. Exp. (2018)

本视频演示了一种用于评估乳链菌肽变体抗菌活性的琼脂孔扩散实验。实验展示了表达膜结合肽酶 NisP 的Lactococcus lactis如何激活在E. coli中产生的乳链菌肽前体，从而形成抑菌圈。这些抑菌圈的大小反映了每种乳链菌肽变体的生物活性。

方案

1. 抗微生物活性测试

1. 在无菌条件下制备GM17-琼脂平板
   1. 在30 °C下，将携带质粒pNG nisPT的指示菌株L. lactis NZ9000接种于M17肉汤培养基（含1% (w/v) 葡萄糖，即GM17）中，并添加5 µg/mL氯霉素，培养过夜。
   2. 测定OD₆₀₀，将新鲜培养基接种至OD₆₀₀ = 0.1，并继续培养至OD₆₀₀ = 0.4–0.6，随后将培养瓶置于冰上冷却。
      注意：每次OD₆₀₀测定将消耗一定体积的菌液。请注意，每块琼脂平板实验需使用1 mL菌液。如有需要，请相应扩大液体培养体积。
   3. 配制1.5%琼脂，称取4.5 g琼脂放入玻璃培养瓶中，加入300 mL ddH₂O，混匀后高压灭菌。
   4. 在300 mL ddH₂O中配制2倍浓缩的2x M17肉汤培养基，随后高压灭菌。
   5. 将含10 µg/mL氯霉素和2%葡萄糖的25 mL 2x M17肉汤与1 mL L. lactis预培养菌液（终体积4% v/v）混合。
   6. 加入25 mL熔融的1.5%琼脂（新近高压灭菌或微波加热熔化）。
      注意：在此之前，需将培养瓶冷却至手感微温（约50 °C），因为L. lactis为中温微生物，对高温敏感。
   7. 将混合液倒入大规格培养皿中，晾干10–15分钟。
   8. 用火焰灼烧玻璃巴斯德吸管末端进行灭菌，待其冷却后，使用较宽的一端在凝固的GM17-琼脂平板上打孔。
2. 样品制备
   1. 取1 mL标记好的E. coli表达菌培养物，置于1.5 mL离心管中，7,000 × g离心3分钟。吸除上清液，将菌体沉淀重悬于500 µL Na-P缓冲液（50 mM磷酸钠缓冲液，pH 7.4，由0.5 M磷酸二氢钠和0.5 M磷酸氢二钠配制而成）中。
   2. 在冰上对样品进行超声处理。将超声探头浸入细胞悬液中，设置超声仪振幅为30%，脉冲模式为开1秒、停5秒，持续处理3分钟。
   3. 将细胞裂解液在13,000 × g下离心10分钟，沉淀细胞碎片。将上清液转移至新的冰上预冷的反应管中。
   4. 用Na-P缓冲液将各细胞提取物的上清液稀释并归一化至1 mL，使OD₆₀₀ = 0.6（相对于收获时的细胞密度）。
3. 活性检测
   1. 将每种归一化后的样品各取40 µL加入指示琼脂平板的孔中（图1）。以400 µg/mL氯霉素作为抗菌阳性对照，以洗脱缓冲液作为空白阴性对照。待所有样品完全扩散进入琼脂后，于30 °C过夜培养。
   2. 使用平板扫描仪或数码相机拍摄琼脂平板图像。可通过手工或ImageJ软件测量抑菌圈直径。

结果

图1. 含尼生素变体的细胞裂解液的抗菌活性检测 通过 使用脯氨酸类似物进行SPI nisin 变体与重组野生型样品的比较。所有样品的 OD₆₀₀-在细胞裂解后，相对于收获的细胞培养密度进行归一化。晕圈表示指示菌株生长抑制形式的生物活性...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
一水合磷酸二氢钠	Carl Roth, Germany	K300.2
磷酸氢二钠	Carl Roth, Germany	P030.2
D-葡萄糖	Carl Roth, Germany	6780	配制 20% (w/v) 溶液，用于加入熔融琼脂中
氯霉素	Carl Roth, Germany	3886.1	L. lactis 的工作浓度为 5 µg/mL，用乙醇配制 37 mg/mL 储存液
M17 肉汤	Sigmal-Aldrich, Germany	56156	商用产品
琼脂粉	Carl Roth, Germany	5210.5
来自 Lactococcus lactis 的乳链菌肽	Sigma-Aldrich, Germany	N5764	商用产品，可用于生物活性参照
1.5 mL Eppendorf 离心管	Eppendorf, Germany	30120086
培养皿（聚苯乙烯，无菌）	Carl Roth, Germany	TA19
Lactococcus lactis NZ9000 pNG nisPT			细菌指示菌株
适用于 1.5 mL Eppendorf 管的台式离心机	Eppendorf, Germany	5427 R
探头式超声波破碎仪	Bandelin, Germany	Sonopuls HD3200 配 MS-72 探头	最大高频输出 200 W