利用重水测量微生物电子传递的动能同位素效应

摘要

来源：Tokunou, Y., 等，电化学检测重氢动力学同位素效应对Shewanella oneidensis MR-1胞外电子传递的影响。J. Vis. Exp. (2018)

本视频展示了一种全细胞电化学方法，用于评估质子传递如何影响电活性细菌中的胞外电子传递（EET）。通过使用重水将质子替换为氘核，该方法测量电流的变化，从而揭示动力学同位素效应，突出质子运动在调控电子流动中的作用。

方案

1. 加入重水以测量EET过程中的同位素效应（图1）
   1. 确认单层生物膜的当前产量 Shewanella oneidensis MR-1稳定且不会迅速增加。若电流急剧上升，需等待电流在10分钟内稳定在5%的增幅范围内，随后加入电子穿梭介质，如100 µM蒽醌-1-磺酸盐（α-AQS）。
      注意： 通过rDNA序列分析和ITO电极上生物膜的扫描电子显微镜图像，确认了在掺铟氧化锡（ITO）电极表面形成了单一微生物菌株的单层生物膜，且无其他微生物污染。为验证电子传递过程（EET）对反应速率的限制作用，可监测添加穿梭型电子介体（如100 µM蒽醌-1-磺酸盐（α-AQS））后的影响。
   2. 加入 40 µL 无氧的 50% (v/v) D₂O₂ 通入电化学反应器中，使用注射器使浓度达到 0.5%（v/v）D₂反应器中的 O。
      注意： 为防止D对生物膜造成损伤₂此外，注射 D₂O滴加。
   3. 等待电流稳定，然后加入 D₂O₂ 最高可达 4.0%（体积比）。
      注意： 要获得KIE值（即存在D时的电流生成速率与不存在D时的电流生成速率之比）₂O 和 H₂O)，检测相同体积的 H₂O加成对当前生产的影响。

结果

图1：添加D₂O对S. oneidensis MR-1单层生物膜电流产生的影响。在含有10 mM乳酸（a）、额外添加100 µM蒽醌-1-磺酸盐（α-AQS）（b）或额外添加2 µM黄素单核苷酸（FMN）（...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
氧化铟锡掺杂氧化物（ITO）电极	GEOMATEC	No.0001	用作工作电极，5Ω/sq
氯化银/氯化钾饱和电极（Ag/AgCl）	HOKUTO DENKO	HX-R5	用作参比电极，Φ0.30mm
铂丝	The Nilaco Cooporation	PT-351325	用作对电极
蒽醌-1-磺酸盐（α-AQS）	TCI	A1428
恒温循环器	AS ONE	TR-1A	用于电化学反应器的温度控制
重水（D，99.9%）	Cambridge Isotope Laboratories, Inc.	DLM-4-PK	动力学同位素效应实验的添加剂