制备人工痰液培养基以在体外模拟囊性纤维化肺部痰液

摘要

来源：Vieira, J.，等。用于研究补充氧气对囊性纤维化气道微生物组影响的模型设计与开发。J. Vis. Exp.（2021）。

本视频展示了制备一种人工痰液培养基的过程，该培养基可模拟囊性纤维化患者肺部痰液的黏度、营养成分和pH值。所得到的培养基为离体研究提供了具有生理相关性的实验平台。

方案

1. 人工痰液培养基的制备

注意：此处列出的数量适用于制备 1 L 最终人工痰液培养基，并假设使用材料表中列出的特定试剂。若制备其他体积或使用不同试剂，必须相应调整数值，以确保获得相同的最终产物。目标浓度详见表 1。

1. 人工痰液化学混合物（ASCM）
   注意： ASCM 占最终培养基体积的 25%。该混合物可长期保存，可批量或提前制备。若需后续使用，请对化学混合物进行高压灭菌，并在室温下安全储存。
   1. 混合各组分化学储备液。
      1. 制备 1 M NaCl 储备液：每升无菌水中加入 58.44 g NaCl。
      2. 制备 1 M KCl 储备液：每升无菌水中加入 74.55 g KCl。
      3. 制备 1 M MgSO₄ 储备液：每升无菌水中加入 246.47 g MgSO₄·7H₂O，或 120.37 g 无水 MgSO₄。
      4. 制备 1 M 葡萄糖储备液：每升无菌水中加入 180.16 g 葡萄糖。
   2. 对化学储备液以及一个空的 250 mL 瓶子进行高压灭菌。高压灭菌条件至少为 121 °C、15 PSI，持续 30 分钟。
   3. 向空的 250 mL 瓶中加入 80.59 mL 无菌水。
   4. 向混合液中加入 152.30 mL 1 M NaCl 储备液。
   5. 向混合液中加入 15.8 mL 1 M KCl 储备液。
   6. 向混合液中加入 610 µL 1 M MgSO₄ 储备液。
   7. 向混合液中加入 700 µL 1 M 葡萄糖储备液。
2. 人工痰液黏蛋白混合物（ASMM）
   注意： ASMM 占最终培养基体积的 50%。确保其与最终批次培养基在同一天制备。
   1. 向一个空的 1 L 瓶中加入 450 mL 无菌水。
   2. 向瓶中加入 50 mL 10x 磷酸盐缓冲液（PBS）。
   3. 向瓶中加入一个一次性磁力搅拌子。
   4. 对含有 PBS 和搅拌子的瓶子进行高压灭菌。
   5. 称取 10 g 黏蛋白粉末并加入 PBS 中。
   6. 剧烈振荡瓶子以初步混匀。
   7. 将瓶子置于带磁力搅拌器的加热板上。将温度设为中高，目标为 50 °C，搅拌速度设为 1100 rpm。逐步提高转速，防止搅拌子脱离磁铁。
      1. 加热并搅拌 15 分钟。
      2. 使用耐热手套拿起瓶子，观察黏蛋白粉末是否从溶液中沉淀。
      3. 若黏蛋白未完全溶解，将瓶子重新放回加热/搅拌装置，每次间隔 5 分钟，直至完全溶解。
   8. 让黏蛋白混合物冷却至室温。
3. 人工痰液生物混合物（ASBM）​
   注意： ASBM 占最终培养基体积的 25%。应在与最终批次培养基相同的当天制备，且与其他混合物不同，其组分不得接触任何热源。
   1. 在 4 °C 冰箱或冰上解冻 100x 维生素储备液。​
      注意： 将维生素储备液预先分装为 10 mL 等份，以减少冻融循环次数。
   2. 向已灭菌的空 250 mL 瓶中加入 124.24 mL 无菌水。
   3. 向混合液中加入 25.76 mL 50x 必需氨基酸储备液。
   4. 向混合液中加入 80.14 mL 100x 非必需氨基酸储备液。
   5. 向混合液中加入 10 mL（已解冻）100x 维生素储备液。
   6. 向混合液中加入 1 mL 1000x 微量金属储备液。
   7. 向混合液中加入 8.33 mL 30% 蛋黄乳剂。
   8. 向混合液中加入 400 µL 10 g/L 铁蛋白储备液。
   9. 通过手动振荡充分混匀溶液。
4. 人工痰液培养基（ASM）
   1. 将 250 mL ASCM 加入含有 ASMM 的 1 L 瓶中。
   2. 将 250 mL ASBM 加入培养基瓶中。
   3. 使用碱性 MOPS 缓冲液（1 M）滴定培养基，使窄范围 pH 试纸显示 pH 值达到 6.3。滴定前，培养基混合物酸性过强。
   4. 将制备好的人工痰液培养基在 4 °C 下冷藏，直至准备过滤。
   5. 开始过滤过程时，将 200 mL 未过滤的人工痰液培养基转移至带有 0.22 µm 孔径滤膜的真空过滤系统中。
   6. 将过滤系统连接至真空泵，开启真空泵，将其设为 70 mbar，然后将滤室置于 4 °C 冷室内的轨道摇床上，以 90 rpm 摇动。
      1. 随着大量液体被过滤，可补充额外 150 mL 培养基。完全过滤 1 L 培养基需要 1–2 天。
      2. 重复使用其他滤室，直至所有培养基均被过滤。
         注意： 尽量不要通过同一张 0.22 µm 滤膜过滤超过 350 mL 培养基，因为黏蛋白会随时间推移堵塞滤膜。
   7. 将过滤后的人工痰液培养基在 4 °C 下冷藏，直至使用。为获得最佳效果，建议在制备后一个月内使用 ASM。

表1： 基于文献综述的人工痰液培养基配方。 （第1列）人工痰液培养基配制中的试剂及关键参数。（第2–7列）现有文献中不同配方的比较。（第8–9列）。

第1列		第2列	第3列	第4列	第5列	第6列	第7列	第8列	第9列
数值		Comstock	Kirchner	Sriramulu	Palmer	Flynn	Gallagher	Lai	来源
黏蛋白		2% w/v	0.5% w/v	0.5% w/v	-	1% w/v	2% w/v	1% w/v	Flynn
氯化钠		85.5 mM	85.5 mM	85.5 mM	66.6 mM	89.8 mM	85.5 mM	152.3 mM	Lapierre
氯化钾		29.5 mM	29.5 mM	29.5 mM	15.8 mM	-	2.95 mM	15.8 mM	Palmer
硫酸镁		-	-	-	0.6 mM	1 mM	1 mM	0.61 mM	Palmer
硫酸亚铁		-	-	-	0.0036 mM	-	-	-	-
氯化铵		-	-	-	2.3 mM	60 mM	-	-	-
磷酸二氢钾		-	-	-	2.5 mM	60 mM	-	-	-
葡萄糖		-	-	-	3.2 mM	13 mM	40 mM	0.7 mM	Sambeek
乳酸		-	-	-	9 mM	-	-	-	-
必需氨基酸		14.45x	0.25 g/L	0.25 g/L	Per Acid	0.5x	0.375x	1.29x	Palmer
非必需氨基酸		28.9x	0.25 g/L	0.25 g/L	Per Acid	0.25x	0.5x	8.01x	Palmer
维生素		-	-	-	-	-	1x	1x	Gallagher
微量元素		-	-	-	-	1x	1x	1x	Flynn
卵黄		0.25%	0.25%	0.25%	-	-	0.25%	0.25%	Kirchner
铁蛋白		0.0003 g/L	-	-	-	-	0.0004 g/L	0.0004 g/L	Gallagher
鲑鱼精子DNA		1.4 g/L	4 g/L	4 g/L	-	-	1.4 g/L	-	-
DPTA		-	-	0.0059 g/L	-	-	-	-	-
pH		-	6.9	-	6.8	-	-	6.3	Lapierre
储存温度		0	4°	-	-	4°	4°	4°	Kirchner
灭菌方式		高压灭菌	过滤灭菌	高压灭菌	-	高压灭菌	高压灭菌	过滤灭菌	Kirchner

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
BME 维生素 (100x) 溶液	MilliporeSigma	B6891	补充维生素的浓缩溶液。
压盖机，30 mm	DWK Life Sciences	224307	用于将铝盖压接至血清瓶的压盖工具。
D-(+)-葡萄糖	MilliporeSigma	G7021	固体葡萄糖粉末（右旋异构体）。
隔膜泵 ME 2 NT	VACUUBRAND	20730003	用于真空过滤的真空泵。
蛋黄乳液	HiMedia	FD045	30% 蛋黄在生理盐水中的无菌乳液。
阳离子化铁蛋白（源自马脾）	MilliporeSigma	F7879	铁蛋白（储铁蛋白）溶液。
FIREBOY plus 安全本生灯	Integra Biosciences	144000	带用户界面和安全功能的本生灯。
Hydrion pH 试纸 (1.0–14.0)	Micro Essential Laboratory	94	用于检测 pH 1.0–14.0 范围的试纸。
Hydrion pH 试纸 (4.0–9.0)	Micro Essential Laboratory	55	用于检测 pH 4.0–9.0 范围的试纸。
Hydrion pH 试纸 (6.0–8.0)	Micro Essential Laboratory	345	用于检测 pH 6.0–8.0 范围的试纸。
Pro EDGE 安全型皮下注射针头，18 G	Smiths Medical	401815	带安全帽的 18 G 针头。
管路压力表	MilliporeSigma	20469	用于监测瓶内气体压力的压力表。
Innova 42 恒温摇床	Eppendorf	2231000756	恒温培养与轨道摇床组合装置。
带针头的鲁尔锁式注射器	Becton Dickinson	309580	3 mL 注射器与 18 G 针头组合。
鲁尔阀套装	World Precision Instruments	14011	用于气体管路的阀门。
LSE 轨道摇床	ThermoFisher Scientific	6780-NP	过滤过程中用于振荡培养基的轨道摇床。
七水合硫酸镁	MilliporeSigma	M2773	固体泻盐（七水合硫酸镁）。
医用空气单级调压阀带流量计	Western Enterprises	M1-346-15FM	带 15 L/min 流量计的空气流速调节器。
MEM 氨基酸 (50x) 溶液	MilliporeSigma	M5550	必需氨基酸的浓缩溶液。
MEM 非必需氨基酸 (100x) 溶液	MilliporeSigma	M7145	非必需氨基酸的浓缩溶液。
Millex-GP 滤器，0.22 µm	MilliporeSigma	SLMP25SS	0.22 µm 聚醚砜膜无菌注射式滤器。
Milli-Q Academic	MilliporeSigma	ZMQS60E01	Milli-Q 无菌水纯化系统。
MiniOX 3000 氧气监测仪	MSA	814365	气体流中氧气浓度百分比监测仪。
MOPS 缓冲液 (1 M, pH 9.0)	Boston BioProducts	BBM-90	用于调节培养基 pH 的 MOPS 缓冲液。
猪胃黏蛋白	MilliporeSigma	M2378	黏蛋白（糖基化凝胶形成蛋白）粉末。
氯化钾	MilliporeSigma	P9541	固体氯化钾盐。
PTFE 一次性搅拌子	ThermoFisher Scientific	14-513-95	一次性磁力搅拌子。
PTFE 螺纹密封聚四氟乙烯胶带	VWR	470042-938	用于加固气体系统连接处的聚四氟乙烯胶带。
Q-Gard 2 纯化滤芯	MilliporeSigma	QGARD00D2	用于 Milli-Q 系统的纯化滤芯。
可重复使用培养基储存瓶	ThermoFisher Scientific	06-423A	用于配制和储存培养基的瓶子。
橡胶塞，30 mm，灰色溴丁基	DWK Life Sciences	224100-331	用于血清瓶的橡胶塞。
带模制刻度的血清瓶，500 mL	DWK Life Sciences	223952	用于密闭培养的玻璃血清瓶。
细管径延长管套装	Braun Medical	471960	带鲁尔锁接头的延长管。
氯化钠	MilliporeSigma	S3014	固体氯化钠盐。
微量元素混合液，1000x	ThermoFisher Scientific	NC0112668	生理浓度微量元素的浓缩溶液。
无衬铝盖，30 mm	DWK Life Sciences	224187-01	压接在橡胶塞顶部的铝盖。