果蝇肠道相关细菌菌落形成单位的定量分析

摘要

来源： Dodge, R., et al. 适用于Drosophila微生物组的96孔板快速菌落形成单位计数法。J. Vis. Exp. (2023)

本视频展示了与肠道相关的细菌菌落形成单位（CFUs）的定量方法 果蝇 采用连续稀释与平板接种法处理果蝇。将含有肠道细菌的匀浆果蝇样品进行系列稀释，接种于琼脂平板，孵育以促进菌落生长。随后利用软件分析平板图像，对每个接种点的菌落进行对齐、分割与计数，从而实现准确的CFU定量。

方案

1. 在96孔PCR板中单独匀浆果蝇

1. 提前准备珠磨板。
   1. 将0.5 µm玻璃珠（参见材料表）倒入珠子测量托盘中。在托盘上铺开珠子，使所有孔均被填满并保持水平，然后将多余的珠子刷入锥形管中回收。
   2. 将半裙边聚合酶链式反应（PCR）板（参见材料表）倒置放在测量托盘上，并通过将其嵌入托盘上的凹槽中与孔对齐。然后迅速翻转，以转移珠子。
   3. 清除PCR板表面多余的珠子，并用铝箔覆盖。检查PCR板，确保所有孔中均含有珠子。如有需要，可使用称量勺向单个孔中添加珠子。如果静电导致珠子粘附在板表面，可用70%乙醇擦拭或喷洒测量托盘背面及PCR板。
   4. 用铝箔覆盖。可按此方法制备多个板，随后进行高压灭菌并储存以备后续使用。使用前，使用96通道移液器向每个孔中加入100 µL磷酸盐缓冲液（PBS）（参见材料表）。
2. 在均质化前，使用70%乙醇对携带微生物的果蝇进行表面灭菌。
   1. 用100% CO₂麻醉果蝇5秒。使用小漏斗将麻醉后的果蝇从试管转移至1.5 mL微量离心管中（图1A-2）。本研究中，通常每管加入25只果蝇。
   2. 立即向管中喷入约1 mL 70%乙醇，盖紧管盖，倒置混匀10秒。然后用P1000移液器吸除乙醇，注意避免吸出果蝇。重复一次乙醇处理，随后用无菌PBS清洗两次（图1A-3）。
3. 最后一次PBS清洗后，盖上管盖，将管倒置，用力在实验台面上敲击数次，使果蝇进入管盖内。
4. 打开管盖，用镊子将果蝇分装至各孔中（图1A-4）。每个孔放入一只果蝇（图1A-5）。加样过程中保持板置于冰上，以维持果蝇的麻醉状态。
5. 使用Thermal Bond热封铝箔密封板（参见材料表）。
   1. 首先清除靠近孔附近的散落珠子，以免造成铝箔密封处泄漏。确保铝箔的哑光面朝下接触板面，光亮面朝上朝向热封仪。将热封仪（参见材料表）用力压下5秒（图1A-6）。使用手动压合器（参见材料表）压平，以确保铝箔密封牢固。
      注意：密封不良是导致样品损失的原因之一。
6. 将板固定在板式振荡器中。均质5分钟（图1A-7）。将珠磨板在微型板式离心机（参见材料表）中以350 × g离心30秒，使液体从密封铝箔上沉降至孔底。
7. 取下铝箔时握住板体，避免孔内果蝇匀浆液滴飞溅。

2. 果蝇匀浆液的系列稀释及点样至CFU平板

1. 放置四个矩形的脱曼、罗戈萨和夏普（MRS）琼脂培养平板（参见 材料表在生物安全柜中打开培养皿并移除盖子。本方案中，使用MRS琼脂培养基用于细菌的生长 L. plantarum将这些平板放置干燥至少10分钟（若为 freshly poured 或来自冷藏储存，则需干燥20分钟）。
   注意如果平板潮湿，96孔板中的液滴会相互融合，导致计数失败。
2. 使用96通道移液器，向无菌96孔板的每孔中加入100 µL PBS，制备三个稀释板。将一排P20吸头装入96通道移液器。
3. 将第1节中制备的样品板中的匀浆液吸取11.1 µL，进行1:10稀释（图1A-8）。务必从孔的中部吸取液体，而非孔的底部，因为果蝇匀浆物和玻璃珠会堵塞移液器吸头。玻璃珠会沉降，果蝇碎片则会上浮，中间层因而较为澄清。
4. 将11.1 µL加入已预先加入100 µL无菌PBS的第一次稀释板各孔中。将稀释板置于板式振荡器上，以600转/分钟（rpm）振荡10秒。再通过移液枪上下吹打5个循环进行混匀。从第一次稀释板中转移11.1 µL至第二次稀释板，并对后续两个稀释板重复上述混匀步骤。
5. 按如下所述进行梯度稀释涂布平板。
   1. 从生物安全柜中取出生长板。
   2. 从最稀释的平板开始，使用96道移液器从每个孔中吸取2 µL样品，点样到琼脂平板上（图1A-9).
      1. 缓慢将移液器枪头放至平板表面，注意不要刺入琼脂。仔细检查平板，确保所有点样位置均已加样；若未完成，手动在相应位置补加 2 µL。检查液体斑点是否迅速渗入琼脂，且未发生扩散融合。
      2. 如果菌落出现连在一起生长的情况，将一组新的新鲜琼脂平板干燥更长时间后重新点样。若存在多种类型的平板（例如不同培养基或含抗生素的平板），也需同时进行点样。将剩余溶液重新加回到稀释平板中，并继续进行下一更高浓度的处理。
         注意点样稀释液时，需将下一稀释度混匀五次，以确保移液器吸头内的前一稀释液被彻底清除。稀释板可保存于 >4 °C 下 8 小时，不影响菌落计数。
6. 按照步骤2.5所述方法，对剩余的稀释平板重复涂布操作，从最稀释的样品开始，逐步至最浓的样品，直至原始匀浆液平板。
7. 当所有液体被琼脂吸收后，将培养皿倒置并放入培养箱中（图1A-10）。对于 植物乳杆菌 和 醋酸杆菌 从 果蝇最适培养温度为MRS培养基上30 °C。培养至菌落达到最佳大小：菌落应足够大以便清晰观察，但又不至于过大而相互融合或干扰生长（参见代表性结果部分对最佳大小的量化说明）。
   注意：最佳生长条件因菌株而异，需通过实验确定。对于 植物乳杆菌属 从 果蝇在MRS琼脂上，最佳孵育时间为26小时至30小时。对于 醋酸杆菌 从 果蝇孵育的最适时间取决于菌株，在MRS培养基上为30至48小时。
8. 孵育后，如需保存以备计数，可将培养皿置于 4 °C 保存。

3. 菌落形成单位（CFUs）的定量

1. 通过拍摄平板照片，然后使用自动化软件计数菌落形成单位（CFUs），具体方法如下。如果平板曾保存在4 °C环境中，应先使其恢复至室温，以避免平板表面产生冷凝水而造成反光。
2. 将平板按逻辑顺序排列，并在拍摄过程中保持该顺序，以便于文件命名。将所有平板的方向调整一致，使A1孔位于平板的左上角。建议在A1角标记唯一编号，以防止照片混淆。将每个稀释梯度系列按顺序叠放。
3. 取下平板盖，将平板放置在成像台上，确保A1孔位于正确的角落。平板成像箱专为拍摄此类培养皿设计，配备照明和滤光选项，可用于荧光菌落成像。
4. 对平板进行成像。使用相机（见材料表）并设置手动模式，以确保各平板间曝光水平一致。建议采用较长焦距设置，以最小化透视畸变。使用遥控快门拍摄照片，以减少因相机抖动造成的模糊。
5. 将图像传输至计算机，并重命名文件，文件名应包含实验名称、培养基类型、稀释倍数及其他相关细节。某些操作系统（见材料表）在Finder中提供批量重命名功能，可通过右键单击所选文件实现，十分便捷。

4. 使用 Count-On-It 套件进行自动菌落计数

1. 使用 ImageJ 提供的 Croptacular 插件对图像进行裁剪。该插件可将图像划分为有序的子区域阵列（例如，96 孔板为 8 × 12）。各个子区域将被单独计数。
   1. 将需要进行定量分析的图像整理至一个文件夹中。选择能够区分不同板的文件名，因为这些文件名将成为每组计数结果的列标题。在该文件夹内，创建名为“cropped”和“receipts”的子文件夹。
   2. 启动 Croptacular，点击 确定 开始裁剪。
      注意：默认设置已显示，通常已足够使用。但根据图像分辨率、光照条件、斑点大小等因素，可能需要调整基础参数。
   3. 如果图像已对齐，直接按 空格键 即可。否则，沿应变为水平方向的边缘绘制一条直线以校正图像。若图像仍未对齐，可多次重绘该直线直至对齐。
   4. 接下来，绘制需要计数区域的边界框。调整其大小和比例，确保所有斑点均位于各自的单元格内。将光标拖动至边界框外可刷新网格。当网格显示合适时，按 空格键。
   5. 确保下一张图像自动旋转至与第一张相同的角度；该插件假定所有照片均以相同方式对齐。若此假设成立，则按 空格键 继续；否则，按前述方法校正图像。网格也会沿用前一张图像的相同位置，必要时可进行调整，然后按 空格键。
2. 使用 ImageJ 提供的 Count-On-It: Gridiron 插件对平板上的菌落进行计数。
   1. 启动 Count-On-It > Gridiron。 使用与 Croptacular 相同的网格设置。用户可批量处理整个文件夹、分析单张图像，或从当前图像开始处理。
   2. 根据像素强度的上限和下限值设置阈值。在确保包含所有菌落的前提下，尽可能提高阈值的严格性。理想情况下，被选中的菌落之间应保留一定间隙，但软件具备一定程度的斑点分割能力。当阈值设置满意后，点击“操作要求”对话框中的 确定。
   3. 为检查结果，可放大图像并仔细查看菌落计数。点击取消将中止插件运行。点击 确定 继续。
   4. 在第一张图像上，应提供继续或返回设置菜单的选项，例如用于更改最小菌落尺寸。若要继续批量处理，点击 确定，然后选择用于保存结果单据和结果表格的文件夹。可使用“receipts”文件夹或新建一个文件夹。
   5. 处理完第一张图像后，后续图像将默认使用与前一张相同的阈值。点击 确定 以使用这些设置，或进行调整。若照片一致性良好且设置准确，则在“操作要求”对话框中点击 确定。
      注意：当批量处理的所有图像完成后，结果表格将自动保存在与单据相同的文件夹中。
   6. 检查软件生成的计数单据，并手动修正任何计数错误。ImageJ 插件在统计上是准确的，但仍可能出现错误。需核对单据以检查异常值并识别计数错误。软件将 CFU 数据以 .csv 文件形式保存在与单据相同的文件夹中。
3. 使用用户偏好的软件对数据进行分析。

结果

图1：定植实验采用96孔板形式，可对数百只果蝇个体中的菌落形成单位（CFU）进行测量。（A）定植实验及高通量定量方法的示意图，具体操作详见方案部分。（B）利用高通量CFU定量方法，在不同条件下检测果蝇体内Lactiplantibacillus plant...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
珠磨与点种平板
果蝇小瓶	Genesee	32-121	可高压灭菌
果蝇小瓶塞	Genesee	59-201	可高压灭菌
手动涂布器	3M	3M PA1
热封仪	Eppendorf	5390
Mini-Beadbeater 96	BioSpec	1001
Mini-BeadBeater 玻璃珠，0.5 mm	BioSpec	11079105
MPS 1000 Mini PCR 板离心机	Labnet	LI-CF-P1000
Rainin BenchSmart 96 半自动移液器	Mettler Toledo	30296705	有更经济的替代选项，包括 VP Scientific 提供的 96 孔槽式移液针工具
TempPlate 半裙边 96 孔 PCR 板，直边，无色	USA scientific	1402-9220	必须为聚丙烯材质，以便使用热封仪
Thermal Bond 热封膜	4titude	4ti-0591	保持无菌
托盘板，128 × 85 mm，聚苯乙烯，无菌	SPL Life Sciences	31001	用于制备矩形琼脂平板
摄影箱构建
¼”-20 × ½” 螺栓（×2）	Amazon	ASIN: B07BP1WR3H	用于连接相机支架。品牌不重要。任何 1/4"-20 规格、长度 1/2" 的螺栓均可使用。
¼”-20 × ½” 连接螺母	Amazon	UPC: 799862376780	又称帽形螺母或连接螺栓。用于在平板支架上固定橡皮筋。品牌不重要。
¼”-20 × ¾” 螺栓（×3）	Amazon	ASIN: B003QZSZY4	用于平板支架。品牌不重要。
1/8” × ½” 垫圈	Amazon	UPC: 611982484599	用于箱体外部的帽形螺母。品牌不重要。安装前喷涂为黑色，以与亚克力材料协调。
18 号双芯电源线 - 18 AWG 电源线 – 10 英尺	Superbrightleds.com	WP18-2
22-10 AWG 红色接线帽 - WN-R2210 – 数量 4	Superbrightleds.com	WN-R2210
22-18 AWG 3/16 英寸母端推入式连接器 - 22-18 AWG – 数量 3	Superbrightleds.com	SCFP-2218
4 英寸免焊夹式跳线连接器 - 8 mm 单色 LED 灯带 – 数量 3	Superbrightleds.com	SBL-MA2P-8-2
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6 英寸抽屉把手	Amazon	ASIN: B07Z331P99	任何抽屉把手均可使用。
6 英寸抽屉滑轨	Btibpse	UPC: 712243424979	修剪抽屉滑轨上的缓闭橡胶限位器。
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8-32 × ½” 尼龙螺栓（×4）	Amazon	ASIN: B07KX9T7NF	用于安装抽屉滑轨。品牌不重要。任何符合规格的螺栓或机螺钉均可使用。尼龙材质不会损伤亚克力，且允许将螺栓切至与螺母齐平。安装前喷涂为黑色，以与亚克力材料协调。
亚克力胶水	SCIGRIP	Ean: 7844908489337	SCIGRIP Weld-On #4 胶粘剂，品脱装，含带针头的 Weld-On 施胶瓶
黑色扎带 - 10 个装 - 4 英寸长	Superbrightleds.com	CT-B04-10
相机 L 型支架	WLPREOE, Vikerer, 无品牌	ASIN: B09X46YKQZ	支架应“反向”安装，使相机位于 L 型结构的“外侧”。部分支架为两件式设计，支持此反向配置，部分则不支持，需选择可翻转的型号。支架还应具有 1/4" 安装孔。示例品牌：WLPREOE, Vikerer, 无品牌。Amazon 序列号仅作示例。
佳能 T 系列相机（支持有线连接）或	Canon, Panasonic, Sony, Nikon 等	1894C002	佳能 Ti 系列相机是良好选择，可连接计算机。建议搭配 18-55 mm 标准套机镜头使用。推荐使用从佳能 T5 到 T7（当前型号）的二手设备。
定制长度单色 LED 灯带 - Eco 系列胶带灯 - 24 V - IP20 - 250 流明/英尺 - 蓝色 - 2 米	Superbrightleds.com	STN-BBLU-B6A-08C1M-24V
定制长度单色 LED 灯带 - Eco 系列胶带灯 - 24 V - IP20 - 250 流明/英尺 - 绿色 - 2 米	Superbrightleds.com	STN-BGRE-B6A-08C1M-24V
定制长度单色 LED 灯带 - Eco 系列胶带灯 - 24 V - IP20 - 250 流明/英尺 - 自然白 4000 K - 2 米	Superbrightleds.com	STN-A40K80-B6A-08C1M-24V
配备 ¼” 和 1/8” 钻头的电钻	Black & Decker	‎BDCDD12PK	品牌不重要。
哑光黑色喷漆，2X 超哑光	Rustoleum	331182	将所有部件内部喷涂为完全哑光黑色。品牌不重要。
激光切割亚克力板壁	Big Blue Saw	www.bigbluesaw.com	使用附带的 PDF 文件，仅保留顶板上所需的相机孔，删除其余所有开孔
明纬 LED 开关电源 - LPV 系列 20-100 W 单路输出 LED 电源 - 24 V 直流 - 20 瓦	Superbrightleds.com	LPV-20-24
松下 ZS100，支持通过 Wi-Fi 连接手机、平板或计算机	Canon, Panasonic, Sony, Nikon 等	DMC-ZS100K	松下相机可通过无线方式连接计算机，实现数据传输和远程快门控制。二手设备即可满足需求。
快装板	Neewer 铝制 50 mm 快装板 QR 夹具，带 3/8 英寸和 1/4 英寸接口	ASIN: B07417F21D	安装于支架上，便于更换颜色滤光片时快速拆卸相机。Amazon 序列号仅作示例。
橡皮筋，多种尺寸	BAZIC Products	Alliance Rubber 26649	用于平板支架。品牌不重要。
螺丝/粘贴式扎带安装底座 - 3/4 英寸底座 – 数量 4	Superbrightleds.com	CTMB-20
单刀单掷圆形翘板开关 - 无 LED – 数量 3	Superbrightleds.com	RRS-SP
Tiffen 29 滤光片（红色）72 mm	Tiffen	72R29
Tiffen 58 滤光片（绿色）72 mm	Tiffen	7258
软件
ImageJ64	https://imagej.net/downloads	N/A	免费软件。引用方式：Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., Frise, E., Kaynig, V., Longair, M., Pietzsch, T., … Cardona, A. (2012). Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods, 9(7), 676–682. doi:10.1038/nmeth.2019
MacOSX	Apple	N/A	Finder 中具有实用的批量重命名功能，便于对一组照片进行重命名，以利于在 Count-on-it 中组织和分析。
Unix	BSD	N/A	64 位
Windows	Microsoft	N/A	64 位