金属限制条件下细菌生长实验：研究金属响应基因功能

摘要

来源： Maurakis, S., 等金属限制条件下的生长 淋病奈瑟菌 用于表征金属响应基因及从宿主配体获取金属的研究。 视频实验杂志. (2020).

本视频演示了一种在金属受限条件下的细菌生长实验，用于研究金属响应基因的功能。将野生型和突变型细菌在缺乏金属的培养基中培养后，加入金属-配体复合物并利用酶标仪监测其生长情况。在缺金属条件下，野生型细菌表达一种位于表面的受体，介导金属吸收并支持生长，而突变型菌株缺乏该受体，因而生长受到限制。

方案

1. Chelex 处理的限定培养基（CDM）储备液的制备

1. 储备液 I
   1. 将氯化钠（NaCl）（233.8 g）、硫酸钾（K₂SO₄）（40.0 g）、氯化铵（NH₄Cl）（8.8 g）、磷酸氢二钾（K₂HPO₄）（13.9 g）和磷酸二氢钾（KH₂PO₄）（10.9 g）溶于去离子水中，定容至 1 L。
   2. 过滤除菌后分装至 50 mL 锥形管中。
   3. 于 -20 °C 保存。
2. 储备液 II
   1. 将盐酸硫胺素（HCl）（0.2 g）、氯化硫胺素焦磷酸盐（0.05 g）、泛酸钙（0.19 g）和生物素（0.3 g）溶于 50%（体积/体积）乙醇中，定容至 1 L。
   2. 分装至 50 mL 锥形管中，于 -20 °C 保存。
3. 储备液 III
   1. 将 L-天冬氨酸（4.0 g）、L-谷氨酸（10.4 g）、L-精氨酸（1.2 g）、甘氨酸（0.2 g）、L-丝氨酸（0.4 g）、L-亮氨酸（0.72 g）、L-异亮氨酸（0.24 g）、L-缬氨酸（0.48 g）、L-酪氨酸（0.56 g）、L-脯氨酸（0.4 g）、L-色氨酸（0.64 g）、L-苏氨酸（0.4 g）、L-苯丙氨酸（0.2 g）、L-天冬酰胺-水合物（L-asparagine-H₂O）（0.2 g）、L-谷氨酰胺（0.4 g）、L-组氨酸盐酸盐（L-histidine-HCl）（0.2 g）、L-蛋氨酸（0.12 g）、L-丙氨酸（0.8 g）、L-赖氨酸（0.4 g）和还原型谷胱甘肽（0.36 g）溶于 500 mL 去离子水中。
   2. 将 L-半胱氨酸（0.44 g）和 L-胱氨酸（0.28 g）溶于最小体积（约 1 mL）的 1 M HCl 中，然后加入上述氨基酸溶液中。
   3. 用 10 N 氢氧化钠（NaOH）调节溶液 pH，直至所有不溶物完全溶解。最终 pH 为 10.0–11.0。
   4. 用去离子水定容至 1 L。
   5. 过滤除菌后分装为 250 mL 每份。
   6. 于 -20 °C 保存。
4. 储备液 IV
   1. 将葡萄糖（200 g）溶于去离子水中，定容至 1 L。
      注意：可能需要加热以促进葡萄糖溶解。
   2. 过滤除菌后分装至 50 mL 锥形管中。
   3. 于 -20 °C 保存。
5. 储备液 V
   1. 将次黄嘌呤（5.0 g）、尿嘧啶（5.0 g）和 NaOH（4.0 g）溶于去离子水中，定容至 1 L。
   2. 过滤除菌后分装至 50 mL 锥形管中。
   3. 于 -20 °C 保存。
6. 溶液 VI
   1. 在去离子水中配制 1 M 氯化钙二水合物（CaCl₂-2H₂O）（147 g/L）溶液。过滤除菌后室温（RT）保存。
7. 储备液 VII
   1. 在去离子水中配制 1 M 无水硫酸镁（MgSO₄）溶液。过滤除菌后室温（RT）保存。
8. 储备液 VIII
   1. 在去离子水中配制 1 M 碳酸氢钠（NaHCO₃）溶液。过滤除菌后室温（RT）保存。

2. 4倍无菌浓缩液和1倍化学成分确定培养基（CDM）的制备

注意：该操作应在经酸处理的无菌玻璃器皿或塑料器皿中进行，以防止金属浸出进入溶液中。

1. 将溶液 I（50 mL）、溶液 II（20 mL）、溶液 III（250 mL）、溶液 IV（50 mL）和溶液 V（20 mL）与 20.0 g 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）混合，搅拌至溶解。
2. 调节 pH 至 7.4，然后用去离子水定容至 500 mL。
3. 在将 Chelex-100 树脂加入 4 倍无菌浓缩液之前，先用 1 L 去离子水洗涤以去除防腐剂。具体操作为：将 50 g 树脂加入 1 L 去离子水中，搅拌至少 1 小时。通过真空过滤去除水，所得洗涤后的树脂用于步骤 2.4。
4. 加入 50 g 树脂，并缓慢搅拌恰好 90 分钟。
5. 通过过滤除菌去除树脂，将 4 倍无菌浓缩液于 4 °C 保存。
6. 为制备 CDM 的 1 倍工作浓度溶液，首先用无菌去离子水稀释 4 倍浓缩液，然后加入溶液 VI（每 500 mL 1 倍溶液加 125 µL）、溶液 VII（每 500 mL 加 535 µL）和溶液 VIII（每 500 mL 加 10 mL）。
   注意：尽管所有储备液均已灭菌，但建议在配制完成后再次对 1 倍溶液进行过滤除菌。

3. CDM 平板的制备

注意：以下配方可制备 1 L 用于平板的培养基，但建议以较小体积进行配制。所有成分均可按比例相应减少。

1. 洗涤琼脂糖
   1. 将50 g琼脂糖溶解于1 L去离子水中，搅拌1 h。
   2. 将溶液转移至离心瓶中，在室温下以1,200 × g 离心15 min。小心倾去上清液并弃去。
   3. 加入足量去离子水重悬琼脂糖沉淀，然后转移至1 L烧瓶中。用去离子水定容至1 L，按步骤3.1.2进行搅拌和离心。弃去上清液。
   4. 加入足量100%乙醇重悬沉淀，然后转移至新的1 L烧瓶中。用乙醇定容至1 L。按步骤3.1.2进行搅拌和离心。
   5. 重复步骤3.1.4。
   6. 加入甲醇重悬琼脂糖沉淀，然后转移至1 L烧瓶中。用甲醇定容至1 L。按步骤3.1.2进行搅拌和离心。
   7. 重复步骤3.1.6。
   8. 将洗涤后的琼脂糖转移至铺有铝箔的托盘中，在通风橱内干燥。干燥后，转移至无金属污染的容器中长期保存。
2. 将10 g洗涤后的琼脂糖和5 g马铃薯淀粉加入750 mL去离子水中。
3. 在121 °C、高于大气压100 kPa条件下高压灭菌30 min。
4. 让培养基冷却至约65 °C，然后加入250 mL 4X CDM、250 µL溶液VI、1.07 mL溶液VII和20 mL溶液VIII。
5. 如需要，可在倒平板前加入所需金属。无需添加螯合剂即可维持无金属条件。
6. 倒入培养皿，使其凝固。

4. 金属限制生长 Neisseria gonorrhoeae

注意：对于大多数应用，接种化学成分明确培养基（CDM）前无需对细菌进行金属胁迫处理。在CDM中进行的初始倍增步骤及后续稀释已足以耗尽淋球菌内部的铁和锌储备。因此，以下操作程序的前两个步骤使用由淋球菌（GC）培养基基础制备的琼脂平板，并添加Kellogg补充剂I和12.5 μM硝酸铁（Fe(NO₃)₃）。若需早期施加金属胁迫，建议制备不含Fe(NO₃)₃的GC培养基平板，并添加5 μM TPEN（N,N,N',N'-四(2-吡啶甲基)乙二胺）以螯合锌，或添加10 μM去铁胺以螯合铁。所有培养均在37 °C、5% CO₂条件下进行。

1. 实验前两天（第 -2 天），从冷冻保存的菌种中划线接种淋球菌至 GC 培养基平板上，培养时间不超过 24 小时。
2. 实验前一天（第 -1 天），挑取单菌落划线接种至新的 GC 培养基平板上。尽量在生长实验开始前 14–16 小时完成此操作。
3. 实验当天，向经酸洗处理的 125 mL 带挡板侧臂烧瓶中加入 5–10 mL 1x CDM 培养基，并用其校准 Klett 比色计。
4. 使用无菌棉签从生长良好的单菌落中取样，接种至 CDM 培养基中，目标浓度为 20 Klett 单位。
   注意：若无 Klett 比色计，也可使用分光光度计。目前尚无 Klett 单位与 OD 值之间的通用换算公式，但可参考粗略对照表（https://support.hunterlab.com/hc/en-us/articles/214490283-Klett-Color-Scales）。
5. 在 250 rpm 条件下振荡培养，直至培养物增长约一倍（达到 40 Klett 单位），通常需要 1–2 小时。
6. 此时，通过加入适量 CDM 培养基将培养物回稀，使其密度降至初始培养密度的一半（例如，若 5 mL 培养物从 20 Klett 单位增长至 40 Klett 单位，则加入 15 mL CDM 可使其降至 10 Klett 单位），随后继续按步骤 4.5 的方式培养。具体的回稀体积、金属处理条件等需根据后续实验应用而定。下文提供三个示例

5. 金属限制生长实验

注意：这些检测方法描述的是预混的生长培养基。这些混合液的制备方法在第6节中说明。

1. 在步骤 4.5 的质量倍增期间，用 10x 预混液预处理 96 孔微孔板的各孔。另外，指定三个孔作为空白对照。向这些孔中加入 10 µL 的 10x 预混液和 90 µL 的 CDM。
2. 当侧臂烧瓶中的培养物完成倍增后，将每种培养物各 100 µL 加入微孔板中未使用的孔内，并在 600 nm 波长下测定光密度（OD600）。此操作可使用比色皿在分光光度计中进行，但当检测菌株数量较多时，该方法会变得繁琐，通常不建议采用，除非您的分光光度计可直接从侧臂烧瓶的侧臂进行测量。
   1. 在测定 OD 时，将烧瓶放回培养箱中，以确保淋球菌保持活性。
3. 计算将培养物稀释至 OD600 = 0.02 所需的正确稀释量。10x 预混液对 OD 的影响可忽略不计，在计算中可不予考虑。
4. 用 CDM 在小型培养管中稀释培养物，并加入足够体积，使微孔板中的 10x 预混液稀释至 1x。如果具备板式加热器，在操作过程中保持微孔板温度为 37 °C。
5. 将微孔板在酶标仪中振荡培养 8–12 小时，并在设定的时间间隔内测定 OD600 值。

6. 转铁蛋白、S100A7 和钙卫蛋白的金属负载及10倍预混液的制备

注意：与CDM制备相同，溶液配制过程中应使用酸洗过的玻璃或塑料器皿。

1. 将人转铁蛋白溶解于初始缓冲液（100 mM Tris、150 mM NaCl、20 mM NaHCO₃，pH = 8.4）中，浓度为 10 mg/mL（125 μM）。S100A7 和钙卫蛋白悬浮于含 20 mM Tris、100 mM NaCl、10 mM 2-巯基乙醇和 1 mM 氯化钙（CaCl₂），pH = 8.0 的缓冲液中。
   1. 向转铁蛋白溶液中加入铁化溶液（100 mM 柠檬酸钠、100 mM NaHCO₃、5 mM 三氯化铁六水合物（FeCl₃-6H₂O），pH = 8.4），使铁饱和度达到 30%（例如，对于 5 mL 浓度为 10 mg/mL 的转铁蛋白溶液，加入 75 µL 铁化溶液较为合适）。
   2. 向 S100A7 或钙卫蛋白中加入硫酸锌（ZnSO₄），其摩尔比为蛋白的 50%，以实现 25% 的锌饱和度（每个蛋白分子具有两个金属结合位点）。可使用含 100 μM S100A7 或钙卫蛋白和 50 μM ZnSO₄ 的溶液。
   3. 上述两种情况均需进行翻转混匀至少 1 小时，以完成金属负载。
2. 配制 4 L 透析缓冲液（40 mM Tris、150 mM NaCl、20 mM NaHCO₃，pH = 7.4），将其分为两个 2 L 的等份，并将其中一份置于 4 °C 下。
3. 使用注射器将负载金属的蛋白加入透析盒中，并在室温下对第一份缓冲液体积透析 4 小时。
4. 将透析盒转移至第二份缓冲液中，在 4 °C 下过夜透析。经过上述步骤后，未结合的金属应已被去除。
   注意：建议采用双辛可宁酸（BCA）法测定透析后蛋白浓度。
5. 使用 10 倍浓缩的转铁蛋白预混液，作为唯一铁源。
   1. 通过将 30% 铁饱和人转铁蛋白和牛无铁转铁蛋白（按人转铁蛋白方法制备至 125 μM，但不进行加铁步骤）分别稀释至 75 μM 和 30 μM，溶于磷酸盐缓冲液（PBS）中，制备该预混液。阳性对照预混液用 75 μM Fe(NO)₃ 替代 30% Fe-转铁蛋白，阴性对照预混液则不添加任何铁，仅保留牛无铁转铁蛋白。在生长实验中，将 10 µL 上述浓缩液与 90 µL 培养基混合。最终浓度为 7.5 μM 30% 人 Fe-转铁蛋白和 3 μM 牛无铁转铁蛋白。
6. 使用经修改的 10 倍转铁蛋白预混液，作为 S100A7 或钙卫蛋白的唯一锌源。
   1. 阳性对照预混液中，在转铁蛋白预混液中加入 50 μM ZnSO₄；阴性对照中则加入 50 μM TPEN 并省略锌。然后，为每个所需样品孔取 10 µL 上述预混液，转移至新管中，并加入等体积一半的无菌 PBS。例如，若 10 个孔需加入阳性对照预混液，则取 100 µL 预混液转移至新管，并加入 50 µL PBS。阴性对照同样处理。
   2. 制备 S100A7 或钙卫蛋白预混液时，为每个所需孔取 10 µL 阴性对照预混液，转移至新管中，并加入其体积一半的 25% Zn-S100A7 或钙卫蛋白溶液。在生长实验中，使用 15 µL 预混液与 85 µL 培养基稀释。转铁蛋白的最终浓度与步骤 8.5 相同，额外添加 5 μM 的 Zn、TPEN 或 S100A7/钙卫蛋白。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
125 mL 带侧臂烧瓶	Bellco	2578-S0030	需定制订购
2-巯基乙醇	VWR	M131	在通风橱中开启
3MM 滤纸	GE Health	3030-6461	文中称为“滤纸”
琼脂糖	Biolone	BIO-41025	粉末
氯化铵	Sigma-Aldrich	A9434	粉末
牛转铁蛋白	Sigma-Aldrich	T1428	粉末
二水合氯化钙	Sigma-Aldrich	C5080	粉末
泛酸钙	Sigma-Aldrich	C8731	粉末
钙卫蛋白	N/A	N/A	由合作方提供
Chelex-100 树脂	Bio-Rad	142-2832	使用前需用去离子水洗涤
棉质无菌拭子	Puritan	25-806	此应用中棉质优于聚酯材质
去铁胺	Sigma-Aldrich	D9533	粉末
D-葡萄糖	Sigma-Aldrich	G8270	粉末
透析盒	Thermo	66380	使用前需在缓冲液中预浸泡
乙醇	Koptec	V1016	易燃液体，应存放于易燃品柜中
氯化铁	Sigma-Aldrich	F7134	刺激性物质，避免吸入
九水合硝酸铁	Sigma-Aldrich	F1143	刺激性物质，避免吸入
GC 培养基基础	Difco	228950	粉末，已含琼脂
甘氨酸	Sigma-Aldrich	G8898	粉末
HEPES	Fisher	L-15694	粉末
人转铁蛋白	Sigma-Aldrich	T2030	粉末
次黄嘌呤	Sigma-Aldrich	H9377	粉末
Klett 比色计	Manostat	37012-0000	利用透光率评估培养物密度
L-丙氨酸	Sigma-Aldrich	A7627	粉末
L-精氨酸	Sigma-Aldrich	A5006	粉末
L-天冬酰胺一水合物	Sigma-Aldrich	A8381	粉末
L-天冬氨酸	Sigma-Aldrich	A9256	粉末
L-半胱氨酸盐酸盐	Sigma-Aldrich	C1276	粉末
L-胱氨酸	Sigma-Aldrich	C8755	粉末
L-谷氨酸	Sigma-Aldrich	G1251	粉末
L-谷氨酰胺	Sigma-Aldrich	G3126	粉末
L-组氨酸盐酸盐一水合物	Sigma-Aldrich	H8125	粉末
L-异亮氨酸	Sigma-Aldrich	I2752	粉末
L-亮氨酸	Sigma-Aldrich	L8000	粉末
L-赖氨酸	Sigma-Aldrich	L5501	粉末
L-蛋氨酸	Sigma-Aldrich	M9625	粉末
L-苯丙氨酸	Sigma-Aldrich	P2126	粉末
L-脯氨酸	Sigma-Aldrich	P0380	粉末
L-丝氨酸	Sigma-Aldrich	S4500	粉末
L-苏氨酸	Sigma-Aldrich	T8625	粉末
L-色氨酸	Sigma-Aldrich	T0254	粉末
L-酪氨酸	Sigma-Aldrich	T3754	粉末
L-缬氨酸	Sigma-Aldrich	V0500	粉末
硫酸镁	Sigma-Aldrich	M7506	粉末
甲醇	VWR	BDH1135-4LP	易燃液体，应存放于易燃品柜中
磷酸氢二钾	Sigma-Aldrich	60356	粉末
磷酸二氢钾	Sigma-Aldrich	P9791	粉末
硫酸钾	Sigma-Aldrich	P0772	粉末
马铃薯淀粉	Sigma-Aldrich	S4251	粉末
还原型谷胱甘肽	Sigma-Aldrich	G4251	小心操作，易被氧化
S100A7	N/A	N/A	由合作方提供
碳酸氢钠	Sigma-Aldrich	S5761	粉末
氯化钠	VWR	470302	粉末
柠檬酸钠	Fisher	S279	粉末
氢氧化钠	Acros Organics	383040010	极易吸湿
盐酸硫胺素	Sigma-Aldrich	T4625	粉末
硫胺素焦磷酸	Sigma-Aldrich	C8754	又称辅羧酶
TPEN	Sigma-Aldrich	P4413	粉末
Tris	VWR	497	粉末
尿嘧啶	Sigma-Aldrich	U0750	粉末
七水合硫酸锌	Sigma-Aldrich	204986	刺激性物质，避免吸入