表面金属转运蛋白的检测 淋病奈瑟菌 使用点印迹法

摘要

来源： Maurakis, S.，和 Cornelissen, C. N. 金属限制条件下的生长 Neisseria gonorrhoeae 用于表征金属响应基因及从宿主配体获取金属的研究。 视频实验杂志 (2020)

本视频演示了检测细胞表面金属转运蛋白的实验步骤 淋病奈瑟菌 在金属限制条件下培养，通过点印迹分析法检测，涉及配体结合、抗体检测及比色显色。

方案

1. 外膜金属转运蛋白对配体结合的检测

1. 用三倍体积的CDM（经chelex处理的化学成分明确培养基）对菌液进行回稀释。
2. 随后在摇床中孵育4小时。
3. 在接近4小时时，裁剪三片滤纸和一片硝酸纤维素膜，大小约为适合点印迹装置使用。将硝酸纤维素膜预先浸泡于去离子水中，然后将装置组装，滤纸置于硝酸纤维素膜下方。
4. 在4小时时间点，记录细胞密度，并调整至适当的终浓度。
5. 将细胞培养液用移液器加到硝酸纤维素膜上，留出足够时间使滤纸完全吸收液体。
6. 拆卸装置，让印迹自然干燥，并在含5%牛血清白蛋白或脱脂奶粉（w/v）的Tris缓冲盐水中封闭硝酸纤维素膜1小时。
7. 重新组装点印迹装置，将滤纸替换为石蜡膜，以在硝酸纤维素膜下方形成防漏密封。
8. 将感兴趣的金属结合配体用封闭液稀释至0.2 μM，孵育细胞1小时进行探针标记。
9. 用真空泵吸去液体，洗涤印迹，然后按照标准免疫学方法显色。洗涤步骤可在装置内或装置外进行。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
125 mL 带侧臂锥形瓶	Bellco	2578-S0030	必须定制订购
2-巯基乙醇	VWR	M131	需在通风橱中开启
3MM 滤纸	GE Health	3030-6461	文中称为“滤纸”
印迹级封闭剂	Bio-Rad	170-6404	脱脂奶粉
牛血清白蛋白	Roche	3116964001	粉末状
钙卫蛋白	N/A	N/A	由合作方提供
Chelex-100 树脂	Bio-Rad	142-2832	使用前需用去离子水洗涤
棉质无菌拭子	Puritan	25-806	此应用中棉质优于聚酯材质
点印迹装置	Schleicher & Schuell	10484138	加样前应尽可能紧密地锁紧盖子
乙醇	Koptec	V1016	易燃液体，应储存于易燃品柜中
Klett 比色计	Manostat	37012-0000	利用透射色度评估培养物密度
甲醇	VWR	BDH1135-4LP	易燃液体，应储存于易燃品柜中
硝酸纤维素膜	GE Health	10600002	使用前应保持在保护鞘内
S100A7	N/A	N/A	由合作方提供
氯化钠	VWR	470302	粉末状
Tris	VWR	497	粉末状