使用GFP/荧光素酶报告系统测定Mycobacterium smegmatis的错译率

摘要

来源：Chen, Y., 等，利用功能获得性报告系统测量特异性分枝杆菌错译率。J. Vis. Exp. （2019）

本视频演示了一种利用可诱导的 GFP 和分泌型突变荧光素酶报告系统，定量分析Mycobacterium smegmatis中翻译错误的方法。该方法展示了如何测量由翻译错误产生的发光信号，并将其与 GFP 荧光进行比较，以评估待测分子对翻译准确性的影响。

方案

1. Nanoluc 荧光素酶（Nluc）/绿色荧光蛋白（GFP）报告系统

注意： 有关本方法的可视化表示，请参见 图1。

1. 从-80 °C保存的菌种中接种细菌报告菌株至2 mL 7H9培养基中，在37 °C下振荡培养1至2天，直至OD₆₀₀达到稳定期（OD >3）。
2. 将菌液转接到50 mL 7H9培养基中继续培养，直至OD₆₀₀达到后期稳定期（>4）。
3. 在将细菌分装至96孔板前，加入终浓度为50 ng/mL的无水四环素（ATC），充分混匀。对大量培养物进行诱导可确保所有孔中均含有相同浓度的诱导剂，并使报告系统的诱导同步化。将菌液分装至透明圆底96孔板中，每孔体积为100 μL。
4. 为筛选影响错译率的小分子化合物，将待测化合物以指定浓度加入选定孔中。本实验方案以春日霉素（剂量见图2）为例进行说明。向选定孔中加入不同剂量的春日霉素（每个实验组应至少包含两个生物学重复）。
5. 在37 °C下振荡并诱导样品16–20小时。
   注意：必须使用封板膜密封培养板。此外，所有边缘孔需加入至少200 μL无菌水，以减少测试孔中的蒸发。
6. 使用多通道移液器从每孔中取出80 μL样品，转移至黑色96孔板（以最大化荧光信号检测）。使用发光仪测量GFP信号，积分时间为20 ms。
7. 测量GFP信号后，以3,220 × g离心10分钟。将50 μL上清液转移至白色底96孔板（以最大化化学发光信号检测），向每孔加入50 μL Nluc底物，充分混匀后，使用发光仪测量化学发光信号，积分时间为1,000 ms。
8. 通过将校正后的Nluc化学发光值除以GFP荧光值，计算Nluc/GFP比值：该数值（以任意单位表示）为天冬氨酸错译为天冬酰胺的相对度量指标。

结果

图1：测量错译率Nluc-GFP报告系统的示意图。 将已转化Nluc和GFP报告基因的M. smegmatis新鲜培养物扩增至足够体积，以供所有待测孔板使用（假设每块96孔板约需10 mL）。在将菌液加入各孔之前，向大量培养物中加入ATC以诱导报告基因表达。将孔板置于摇床中过夜培养。为测定相对错译率，将培...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Middlebrook 7H9	BD Difco	271310
无水四环素	Cayman Chemical	10009542
春雷霉素	Sigma	K4013
Nano-Glo 荧光素酶检测试剂盒	Promega	N1120
Fluoroskan Ascent FL 发光检测仪	Thermo	/
检测板，96孔白色，平底高结合表面，无盖	Costar	3922
检测板，96孔黑色，平底高结合表面，无盖	Costar	3925
96孔细胞培养板，平底带盖	Costar	3599
pUV-TetOR-Ag85ASec-Nluc-D140N	NA	NA	一种带有四环素诱导型可分泌突变Nluc荧光素酶的附加体质粒载体
pMC1S-GFP	NA	NA	用于在分枝杆菌L5位点整合并实现四环素诱导型表达GFP的载体