利用无细胞系统合成纳米盘稳定的膜蛋白抗原

摘要

来源： Gilmore, S. F., 等无细胞规模化生产及佐剂添加至一种重组主要外膜蛋白 Chlamydia muridarum 用于疫苗开发。 视觉实验杂志. (2022)

本视频展示了利用双区室系统进行基于纳米盘稳定的膜蛋白抗原的无细胞合成。该装置可维持最佳条件，以实现高效的蛋白质合成、正确的折叠以及稳定地整合到纳米盘中。

方案

用于亚单位疫苗制剂的无细胞制备主要外膜蛋白-端聚物纳米脂蛋白颗粒（MOMP-tNLPs）

1. 使用无细胞方法制备MOMP-tNLPs。
   1. 在设置无细胞反应前两小时，打开原核无细胞蛋白表达试剂盒，取出一种复溶缓冲液并使其融化。融化后，加入一片不含乙二胺四乙酸（EDTA）的蛋白酶抑制剂混合片剂，并使其完全溶解。

2. 使用专为运行5 × 1 mL反应设计的试剂盒进行本方案。

   注意：典型的放大生产规模为3 × 1 mL。

   1. 对于每个1 mL反应，向E. coli裂解液瓶中加入525 µL复溶缓冲液，轻轻滚动以溶解。向含有反应添加剂（如三磷酸腺苷、三磷酸鸟苷）的瓶子中加入250 µL复溶缓冲液，并轻轻滚动以溶解。
   2. 向反应补料瓶中加入8.1 mL复溶缓冲液，用橡胶塞重新封口（注意不要触碰橡胶塞内部），然后轻轻倒置或滚动以溶解。
   3. 向氨基酸混合物瓶中加入3 mL复溶缓冲液，用橡胶塞重新封口，并轻轻倒置或滚动以溶解。
      注意：注意不要触碰橡胶塞内部，以免造成污染。
   4. 向甲硫氨酸瓶中加入1.8 mL复溶缓冲液，轻轻滚动使其溶解，然后置于冰上保存待用。
      
3. 制备反应溶液。
   1. 向E. coli裂解液瓶中加入225 μL复溶的反应混合液、270 μL不含甲硫氨酸的复溶氨基酸混合液以及30 μL复溶的甲硫氨酸。此外，加入400 μL 1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱（DMPC）/端粒树枝状聚合物混合物、15 μg MOMP质粒和0.6 μg Δ49载脂蛋白A1质粒。轻轻滚动或轻摇以混匀。
      注意：确保两种质粒均构建于相同的质粒骨架上。切勿涡旋震荡。
   2. 取20 μL总溶液，置于1.5 mL离心管中，用于绿色荧光蛋白（GFP）表达对照反应（见下文）。
      
4. 制备补料溶液。向补料混合瓶中加入2.65 mL不含甲硫氨酸的复溶氨基酸混合液和300 μL复溶的甲硫氨酸。轻轻滚动或轻摇以溶解。
   注意：此时未使用的复溶缓冲液和甲硫氨酸可放回冷冻保存。
   
5. 将1 mL反应溶液转移至无细胞反应试剂盒提供的内层反应室中，充满后密封。将10 mL补料溶液转移至反应容器的外层腔室中并密封。
   注意：切勿过度填充腔室！内层反应室和内层补料室顶部若存在气泡，将对反应产生不利影响。剩余的反应溶液可置于1.5 mL离心管中，与主反应容器一同孵育。
   
6. 向先前分装的20 µL反应混合物中加入0.5 μL GFP对照质粒（0.5 mg/mL）。
   注意：许多试剂盒均附带用于质量控制的对照质粒。任何带有T7启动子和E. coli核糖体结合位点（RBS）的GFP表达质粒也可用作对照质粒。
   
7. 将反应体系置于摇床中，在300 rpm、30 °C条件下孵育最长18小时。为验证反应是否成功，可在孵育仅15分钟后使用紫外光源检测因对照GFP合成而产生的荧光（图1）。
   注意：这些条件，尤其是温度，可能需要针对其他膜蛋白的表达进行优化。

结果

图1： MOMP-tNLP的表达与纯化。 （A） 试管图像显示，在紫外光源下发出荧光的无细胞反应小份样品成功表达了绿色荧光蛋白（GFP）对照（右侧），而未含GFP质粒的裂解液则无荧光（左侧）。（B） SDS-PAGE后经SYPRO Ruby染色的蛋白...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
粉末状 1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱（DMPC）	Avanti Polar Lipids	850345
1.5 mL 无内毒素离心管	Eppendorf	2600028
C24 恒温培养摇床	New Brunswick Scientific
无细胞表达系统：RTS 500 ProteoMaster E. coli HY 试剂盒	BiotechRabbit	BR1400201
cOmplete 无 EDTA 蛋白酶抑制剂混合物	Roche Molecular Diagnostics	4693132001
轨道摇床
PEG5K-CA8 Telodendrimer（定制合成产品）
pIVEX2.4d 载体	Roche Molecular Diagnostics
质粒大提试剂盒	Qiagen	12162
紫外光源