评估细菌疫苗抗原结构完整性的蛋白质印迹法

摘要

来源： Gilmore, S. F. 等 无细胞规模化生产及佐剂添加至一种重组主要外膜蛋白 Chlamydia muridarum 用于疫苗开发。 J. Vis. Exp. (2022)

本视频演示了使用蛋白质印迹法评估基于纳米颗粒的疫苗复合物中主要外膜蛋白（MOMP）结构完整性的方法。视频概述了蛋白质转膜、抗体标记和荧光成像等关键步骤。

方案

1. 蛋白质印迹

1. 进行蛋白质印迹时，通过 SDS-PAGE 分离主要外膜蛋白（MOMP）–端粒树状大分子纳米脂蛋白颗粒（tNLPs），并根据制造商的说明书，使用商用干式转膜系统及标准设置将凝胶中的蛋白转印至膜上。
   1. 转膜完成后，从转膜叠层中取出印迹膜，并在含 0.2% Tween 20 的封闭缓冲液中，于 4 °C 条件下分别加入 0.5 mg/mL 单克隆抗体（MAb）40 或 0.2 mg/mL 靶向 Δ49ApoA1 蛋白 His 标签的抗 His 标签单克隆抗体（MAbHIS），4 °C 过夜孵育。
      注意：用于印迹的抗体稀释比例分别为：MAb40 为 1:1,000，MAbHIS 抗体为 1:500–1,000。
   2. 用 PBS-T（1× 磷酸盐缓冲液（PBS），0.2% Tween 20，pH 7.4）洗涤每张印迹膜 3 次，每次 5 分钟。
   3. 在含荧光染料标记的二抗（例如红外荧光染料（IRDye））的封闭缓冲液中孵育印迹膜 1 小时，二抗稀释比例为 1:10,000。
   4. 最后一次洗涤后，再次用 PBS-T 洗涤印迹膜 3 次，每次 5 分钟。使用荧光成像仪对印迹膜进行成像。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
iBlot+2:22 干式转膜系统	Life Technologies
iBlot 2 转膜叠层，PVDF	Life Technologies	IB24001
Image Studio V2.0 软件	Li-COR Biosciences
Immun-Blot PVDF 膜	Bio-Rad	1620177
LI-COR Odyssey Fc 成像仪	Li-COR Biosciences
含 0.2% Tween 20 的 TBS 配制的 Odyssey 封闭缓冲液	Li-COR Biosciences	927-50000
旋转摇床
PBS-T（1× PBS，0.2% Tween 20，pH 7.4）
一抗：MAb40（针对 C. muridarum MOMP 可变区 1（VD1）的单克隆抗体）
一抗：MAbHIS，Penta-His 抗体	Qiagen	34660
二抗：IRDye 800CW 山羊抗小鼠 IgG（全重链和轻链）多克隆抗体	Li-COR Biosciences	926-32210