使用高压电穿孔制备和转化细菌

摘要

资料来源： Stefan， A. 等人， 大肠杆菌中蛋白质共表达的多方面益处。 J. Vis. Exp. （2015年）

该视频演示了使用携带抗生素耐药基因的质粒转化大 肠杆 菌的过程，包括细胞制备、电穿孔、回收和转化体的选择。

方案

1. 大肠杆菌 共转化体的分离

1. 制备要转化的适当 大肠杆菌 菌株的电感受态细胞。将所选菌株的单个菌落转移到1ml Luria-Bertani（LB）培养基（分别为10,5和10 g / L的胰蛋白胨，酵母提取物，NaCl）中，并在180 rpm的摇动条件下在37°C下孵育。在 25 ml 新鲜 LB 培养基中以 1：500 稀释预培养物，并将培养物在 37 °C 下孵育。
2. 在对数相（0.6 OD 或光密度）下，以 5,000 x g 离心细胞悬液 20 分钟，并将沉淀重悬于 10%、v/v 冰冷无菌甘油水中原始培养体积的一半。重复此步骤 4 次，将重悬体积减半。最后，将沉淀重悬于甘油/水中，并将细胞悬液分成 50 μl 等分试样。将等分试样在-80°C下储存长达6个月。
3. 将所需的质粒溶解在补充有0.5mM EDTA（乙二胺四乙酸）的无菌水中。在冰上解冻等分试样的电感受态细胞，并与适量（2.5-5ng）载体混合。将混合物分配到适合电穿孔的 0.1 cm 比色皿中，并施加 1.8 kV。
4. 立即将电穿孔细胞转移到1ml SOC（具有分解代谢物抑制的超级最佳肉汤）培养基（补充有0.2%w / v葡萄糖，10mM MgCl 2,2.5mM KCl的LB培养基）中，在摇动下孵育1小时，最后将100μl等分试样转移到含有含有LB琼脂的培养皿中，并含有适当的抗生素。在37°C下孵育O / N。
5. 通过在培养皿上划线单个菌落来纯化转化体。

材料