使用高压电穿孔法进行细菌的制备与转化

摘要

来源：Stefan, A., et al., 大肠杆菌中蛋白共表达的多重优势。J. Vis. Exp. (2015)

本视频演示了用携带抗生素抗性基因的质粒转化Escherichia coli的实验步骤，包括细胞准备、电穿孔、恢复培养及转化子的筛选。

方案

1. 分离 E. coli 共转化子

1. 准备待转化的合适E. coli菌株的感受态细胞。取单个菌落接种于1 ml LB（Luria-Bertani）培养基（胰蛋白胨、酵母提取物、NaCl浓度分别为10、5和10 g/L）中，37 °C、180 rpm振荡培养。将预培养物按1:500比例稀释至25 ml新鲜LB培养基中，37 °C继续培养。
2. 当菌液处于对数生长期（光密度O.D.为0.6）时，于5,000 × g离心20分钟，弃上清，将菌体沉淀用相当于原培养体积一半的冰预冷、无菌、10%（v/v）甘油-水溶液重悬。重复此步骤4次，每次重悬体积减半。最后将菌体沉淀用甘油-水溶液重悬，并分装为每份50 μl。分装后于-80 °C保存，可保存长达6个月。
3. 将目标质粒溶解于含0.5 mM EDTA（乙二胺四乙酸）的无菌水中。将一份电转感受态细胞置于冰上解冻，加入适量（2.5–5 ng）质粒载体，混匀。将混合液转移至适合电穿孔的0.1 cm比色皿中，施加1.8 kV电脉冲。
4. 立即将电穿孔后的细胞转移至1 ml SOC（含分解代谢抑制的超级优化肉汤）培养基（LB培养基添加0.2% w/v葡萄糖、10 mM MgCl₂、2.5 mM KCl）中，37 °C振荡培养1小时，随后取100 μl涂布于含适当抗生素的LB琼脂平板上。37 °C过夜培养。
5. 通过在平板上划线分离单菌落，纯化转化子。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
琼脂	Sigma-Aldrich	A1296
氨苄青霉素	Sigma-Aldrich	A9518
EDTA	Sigma-Aldrich	EDS
甘油	Sigma-Aldrich	G5516
KCl	Sigma-Aldrich	P9541
MgCl₂	Sigma-Aldrich	M2670
NaCl	Sigma-Aldrich	31434
胰蛋白胨	Sigma-Aldrich	95039
酵母提取物	Fluka	70161
0.1 cm 比色皿	BioRad	1652089	用于电穿孔
5415R 离心机	Eppendorf
Allegra 21R 离心机	Beckman
Gene Pulser II 电穿孔仪	BioRad