使用 β-葡萄糖苷酶测定评估细菌的突变频率

Abstract

资料来源： Stefan， A. 等人。蛋白质在大 肠杆菌中共表达的多方面益处。 J. Vis. Exp.（96）， （2015）.

该视频演示了使用 β-葡萄糖苷酶测定评估细菌突变频率。表达校对缺陷 DNA 聚合酶的细菌培养物被连续几代收集。校对减少引起的复制错误可能会激活抑制的 β-葡萄糖苷酶基因。离心和透化后，加入底物，测量酶活性以量化样品中的突变频率。

Protocol

1. 大肠杆菌或大肠杆菌共转化体的分离

1. 制备要转化的适当 大肠杆菌 菌株的电感受态细胞。将所选菌株的单个菌落转移到 1 ml Luria-Bertani （LB） 培养基（分别为 10、5 和 10 g/L）的 Luria-Bertani （LB） 培养基（分别为 10、5 和 10 g/L）中，并在 37°C 下孵育180 rpm。在 25 ml 新鲜 LB 培养基中以 1：500 稀释预培养物，并将培养物在 37 °C 下孵育。
2. 在对数相（0.6 O.D.），将细胞悬液以5,000 x g 离心20分钟，并将沉淀重悬于原始培养体积的一半中的10%，v / v冰冷无菌甘油水中。重复此步骤4次，每次将重悬体积减半。最后，将沉淀重悬于甘油/水中，并将细胞悬液分成 50 μl 等分试样。将等分试样在-80°C下储存长达6个月。
3. 将所需的质粒溶解在补充有0.5mM乙二胺四乙酸（EDTA）的无菌水中。在冰上解冻等分试样的电感受态细胞，并与适量（2.5-5ng）载体混合。将混合物分配到适合电穿孔的 0.1 cm 比色皿中，并施加 1.8 kV。
4. 立即将电穿孔细胞转移到1ml含有分解代谢物抑制（SOC）培养基（补充有0.2%w / v葡萄糖，10mM氯化镁或MgCl 2,2.5mM氯化钾或KCl的LB培养基）的超级最佳肉汤中，在摇动下孵育1小时，最后将100μl等分试样转移到含有含有LB琼脂的培养皿中，并含有适当的抗生素。在37°C下孵育过夜（O / N）。
5. 通过在培养皿上划线单个菌落来纯化转化体。
6. 制备原代转化体的电感受态细胞，并重复步骤1.1至1.5以用进一步的质粒进行转化。
7. 制备共转化体的甘油储备液。在补充有适当抗生素的LB中转移单个菌落，在37°C下摇动孵育，在对数相（0.6 OD）下，以5,000 x g 离心细胞悬液20分钟。将沉淀重悬于含有 15% v/v 甘油的 LB 抗生素培养基中。分装并储存在 – 80 °C 下。

2. 共表达大肠杆菌 DNA 聚合酶 III 野生型 ε 亚基和致突变 εD12A 变体的群体突变分析

1. 将含有 pBAD-ε 和 pGOOD1-εD12A 载体的单个 大肠杆菌 TOP10 菌落转移到 1 ml LB 抗生素培养基中。在37°C下孵育O / N。
2. 在装有新鲜培养基（10 ml）的 3 个烧瓶中以 1：250 稀释预培养物，加入适当的诱导剂（阿拉伯糖、异丙基 β-d-1-硫代吡喃半乳糖苷 （IPTG） 或阿拉伯糖和 IPTG，各 1 mM），并在 37°C 下孵育 8 小时。平行制备非诱导培养物。
3. 收集1ml的等分试样，然后在含有补充或不补充适当诱导剂的新鲜培养基（10ml）的新烧瓶中以1：500稀释。在37°C下孵育O / N。
4. 重复步骤2.2和2.3并收集1ml的等分试样。
5. 确定每种文化中发生的代数。在LB板上转移，100μl适当的连续稀释液接种物和培养物。在37°C下孵育O / N。计算LB板上的菌落，并计算接种物（log_I）和生长结束时培养物（log_C）中存在的细胞数量的对数。要确定代数，请使用公式：（log_C– log_I）/0.301。
6. 以 5,000 x g 离心 20 分钟，并将细胞重悬于 1 ml 50 mM 盐酸三（羟甲基）氨基甲烷 （Tris-HCl），pH 7.6,50 mM NaCl 中。要使细胞透化，请加入 2-3 滴氯仿并涡旋 20 秒。
7. 使用 对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷（PNPGluc）作为底物，测定96孔微孔板中每个等分试样的β-葡萄糖苷酶活性。向每个孔中加入100μl透化细胞和100μl底物（16mg / ml水或H₂O储备溶液）。注意避免井中有气泡。使用酶标仪和适当的滤光片读取 420 nm 处的吸光度。

Materials