利用β-葡萄糖苷酶检测法评估细菌中的突变频率

摘要

来源： Stefan, A., 等. 蛋白质共表达的多重优势 大肠杆菌. 视频实验期刊. (96), (2015).

本视频演示了利用β-葡萄糖苷酶检测法评估细菌突变频率的方法。收集表达校对功能缺陷DNA聚合酶的细菌培养物，连续获取多代细菌样本。由于校对功能下降导致的复制错误可能激活被抑制的β-葡萄糖苷酶基因。经过离心和细胞通透化处理后，加入底物并检测酶活性，以定量不同样本中的突变频率。

方案

1. 分离Escherichia coli 或E. coli 共转化子

1. 准备待转化的相应E. coli菌株的感受态细胞。取单菌落接种于1 ml LB培养基（胰蛋白胨、酵母提取物、氯化钠或NaCl，浓度分别为10、5和10 g/L）中，于37 °C、180 rpm振荡培养。将预培养物按1:500比例接种至25 ml新鲜LB培养基中，于37 °C继续培养。
2. 当菌液处于对数生长期（OD值为0.6）时，于5,000 × g离心20分钟，弃上清，将菌体沉淀用相当于原培养体积一半的10%（v/v）冰预冷无菌甘油-水溶液重悬。重复此步骤4次，每次重悬体积减半。最后将菌体沉淀用甘油-水溶液重悬，并分装为每份50 μl。分装后于-80 °C保存，可保存长达6个月。
3. 将目标质粒溶解于添加了0.5 mM乙二胺四乙酸（EDTA）的无菌水中。在冰上融化一份电转感受态细胞，加入适量载体（2.5–5 ng），混匀。将混合液转移至适用于电穿孔的0.1 cm比色皿中，施加1.8 kV电脉冲。
4. 立即将电穿孔后的细胞转移至1 ml SOC培养基（LB培养基添加0.2% w/v葡萄糖、10 mM氯化镁或MgCl₂、2.5 mM氯化钾或KCl）中，于振荡条件下37 °C孵育1小时，随后取100 μl涂布于含适当抗生素的LB琼脂平板上。于37 °C过夜（O/N）培养。
5. 通过在平板上划线分离单菌落，纯化转化子。
6. 制备初级转化子的电转感受态细胞，并重复步骤1.1至1.5，以进行后续质粒的转化。
7. 制备共转化子的甘油保存菌种。取单菌落接种于添加适当抗生素的LB培养基中，37 °C振荡培养，当菌液达到对数生长期（OD值为0.6）时，于5,000 × g离心20分钟。将菌体沉淀重悬于含15%（v/v）甘油的LB-抗生素培养基中，分装后于–80 °C保存。

2. 共表达野生型ε亚基群体的突变分析 大肠杆菌 DNA聚合酶III及诱变性εD12A变体

1. 将含有 pBAD-ε 和 pGOOD1-εD12A 质粒的 E. coli TOP10 单菌落转移至 1 ml LB-抗生素培养基中，37 °C 过夜培养。
2. 将预培养物按 1:250 比例稀释至 3 个含有新鲜培养基（10 ml）的三角瓶中，分别加入相应的诱导剂（阿拉伯糖、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），或阿拉伯糖与 IPTG 各 1 mM），37 °C 培养 8 小时。同时平行制备未诱导的对照培养物。
3. 取 1 ml 培养物作为等分试样，然后按 1:500 比例稀释至新的含有新鲜培养基（10 ml）的三角瓶中，培养基中可添加或不添加相应的诱导剂，37 °C 过夜培养。
4. 重复步骤 2.2 和 2.3，并收集 1 ml 等分试样。
5. 测定各培养物中发生的细胞代数。将接种物和培养物的适当系列稀释液各 100 μl 转移至 LB 平板，37 °C 过夜培养。计数 LB 平板上的菌落数，计算接种物中细胞数的对数（log_I）和培养结束时培养物中细胞数的对数（log_C）。使用公式：(log_C– log_I)/0.301 计算代数。
6. 以 5,000 × g 离心 20 分钟，将菌体沉淀重悬于 1 ml 含 50 mM 盐酸三羟甲基氨基甲烷（Tris-HCl，pH 7.6）和 50 mM NaCl 的溶液中。为透化细胞，加入 2–3 滴氯仿并涡旋振荡 20 秒。
7. 使用 p-硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷（PNPGluc）作为底物，在 96 孔微孔板中测定各样品的 β-葡萄糖苷酶活性。向每孔加入 100 µl 透化后的细胞悬液和 100 µl 底物溶液（水中或 H₂O 中 16 mg/ml 的储备液）。注意避免孔中产生气泡。使用微孔板读数仪和适当的滤光片测定 420 nm 处的吸光度。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
琼脂	Sigma-Aldrich	A1296
氨苄青霉素	Sigma-Aldrich	A9518
氯仿	Sigma-Aldrich	288306
EDTA	Sigma-Aldrich	EDS
甘油	Sigma-Aldrich	G5516
IPTG	Sigma-Aldrich	I5502
KCl	Sigma-Aldrich	P9541
L-阿拉伯糖	Sigma-Aldrich	A3256
MgCl₂	Sigma-Aldrich	M2670
NaCl	Sigma-Aldrich	31434
PMSF	Sigma-Aldrich	P7626
PNP-葡萄糖苷	Sigma-Aldrich	N7006
四环素	Sigma-Aldrich	87128
Trizma 碱	Sigma-Aldrich	T1503
胰蛋白胨	Sigma-Aldrich	95039
酵母提取物	Fluka	70161
0.1 cm 比色皿	BioRad	1652089	用于电穿孔
5415R 离心机	Eppendorf
Allegra 21R 离心机	Beckman
层析装置 GradiFrac	Pharmacia Biotech
Gene Pulser II 电穿孔仪	BioRad
Microplate Reader 550 酶标仪	Biorad
MiniProtean 3 电泳槽	BioRad
电源	BioRad