来源：Shivaiah, K., 等．从植物叶片组织和蓝细菌中分离质体小球脂滴．J. Vis. Exp. (2022)
该视频展示了从蓝细菌中分离质体小球的过程。首先准备蓝细菌培养物，随后通过机械力破碎细胞。光合色素的释放表明细胞裂解成功。接着使用蔗糖阶梯梯度离心法，根据密度差异分离细胞组分，使低密度的质体小球在梯度顶部形成明显的条带。收集该组分并保存，用于后续分析。
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方法文章
从光合细菌中提取和纯化质体小球
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2025年10月30日
本文内容
摘要
方案
1. 粗提质体小球的分离
- 从蓝细菌中粗提取质体小球
- 培养50 mL菌液 集胞藻属 sp. PCC 6803 培养至稳定期（约7-10天），并将细胞密度调整至750 nm处的光密度（OD750) 为 2.0。培养条件采用 BG-11 培养基，在光照强度为 150 的培养箱中培养 µmol 光子/m2/秒，2% CO2, 32 °C，并在150转/分钟（rpm）持续振荡条件下培养。
- 为了去除多糖，将50 mL培养物在6,000 ×g下离心，收集细胞后进行洗涤。 × 4°C 下 45 分钟 10000 × g 离心 °C，随后去除上清液。接着用50 mL缓冲液A将细胞洗涤两次（表1)。取一部分细胞匀浆液，在离心前保留下来，作为代表性的全细胞样品储存
- 将洗涤后的沉淀重悬于25 mL缓冲液A中，使用法国压裂细胞仪在1,100磅每平方英寸（psi）压力下裂解细胞，重复该过程3次× （每个循环之间将样品置于冰上，以避免蛋白质变性），直至在白光下观察到裂解液颜色由绿色变为红-蓝-绿色。使用预冷的比色皿，并在低温室中进行此步骤。
- 将所得匀浆分装至八个超速离心管中，每管最多装填2.5 mL，总体积不超过3 mL，然后小心地在每管中覆盖400 µL 的培养基 R，形成阶梯梯度。
- 根据需要加入适量的R培养基以精确平衡离心管，随后在150,000 × g条件下离心30分钟 × 4 ℃下离心 °C. 类囊体及其他较重的细胞器（包括任何聚羟基烷酸酯颗粒）将形成沉淀，而质体小球则会明显呈现为蔗糖梯度顶部或靠近顶部的一层黄色油状层。图1C).
- 用注射器和22G针头收集形成的漂浮状粗制质体小球，转移至2 mL离心管中。如有必要，可用针尖将质体小球从超速离心管管壁上刮下。
- 继续至步骤2.2。或者，将粗提质体小球置于-80℃保存 °C 并在后续步骤中进行纯化。
表1：从植物叶片组织或蓝细菌中分离质体小球的缓冲液配方。
| 缓冲液组成 a | |
| 研磨缓冲液 | 50 mM HEPES-KOH (pH 8.0) |
| 5 mM 氯化镁 (MgCl2) | |
| 100 mM 山梨醇 | |
| 5 mM 抗坏血酸 b | |
| 5 mM 还原型半胱氨酸 b | |
| 0.05 % (w/v) 牛血清白蛋白 (BSA) b | |
| R 培养基 | 50 mM HEPES-KOH (pH 8.0) |
| 5 mM MgCl2 | |
| R 培养基 0.2 | 50 mM HEPES-KOH (pH 8.0) |
| 5 mM MgCl2 | |
| 0.2 M 蔗糖 | |
| R 培养基 0.7 | 50 mM HEPES-KOH (pH 8.0) |
| 5 mM MgCl2 | |
| 0.7 M 蔗糖 | |
| 缓冲液 A | 25 mM HEPES-KOH (pH 7.8) |
| 250 mM 蔗糖 | |
| a. 提供的是各缓冲液组分的终浓度。 | |
| b. 必须在分离当天新鲜加入。尽管缓冲液可在分离前一天配制，但某些成分以及所有磷酸酶和蛋白酶抑制剂均需在分离当天新鲜添加。 | |
2. 纯化质体小球的收获
- 蓝细菌处理
- 在四个2.5 mL超速离心管中制备蔗糖梯度，首先加入500 µL步骤1.3获得的粗制质体小球，与750 µL中等浓度R 0.7混合，然后覆盖750 µL中等浓度R 0.2。
- 在4 °C条件下，以150,000 × g离心90分钟。用注射器和22 G针头从蔗糖梯度的上层相收集纯净的质体小球（图1C），并转移至1.5 mL离心管中。
- 将纯净的质体小球分装后在液氮中速冻。可直接于−80 °C保存，或冻干成干粉储存。
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结果
图1：质体小球和类囊体的分离及免疫印迹分析。（A）来自Z. mays的代表性纯化质体小球样品，在从蔗糖梯度中提取之前的形态。（B）来自干燥处理的E. nindensis
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 抗坏血酸 | BDH | BDH9242 | |
| 牛血清白蛋白 | Proliant Biological | 68700 | |
| 法国压力细胞（型号 FA-079） | SLM/Aminco | N/A | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| 氯化镁 | Sigma Aldrich | M8266 | |
| Multitron 摇床培养箱 | Infors HT | N/A | |
| 氢氧化钾 | Fisher Chemicals | M16050 | |
| 还原型半胱氨酸 | MP Biochemicals | 101444 | |
| 山梨醇 | Sigma Aldrich | S3889 | |
| 蔗糖 | Sigma Aldrich | S9378 | |
| Synechocystis sp. PCC 6803 | N/A | N/A | |
| Optima MAX-TL 超速离心机 | Beckman Coulter | A95761 |
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