利用周期性单轴应变对干细胞进行机械刺激

摘要

人们普遍认为，人体内的机械力可以影响细胞的分化和增殖。本文展示了一项视频实验方案，演示如何使用自行设计的生物反应器，对培养在柔性微图案化基底上的干细胞施加单轴循环拉伸应变。

摘要

机械力在生物组织发育与维持过程中的作用已有充分记载，包括多种受力学调控的现象，如骨重塑、肌肉肥大以及平滑肌细胞可塑性。然而，这些过程中涉及的力通常极为复杂，且在体内难以监测和控制。为了更深入地研究机械力对细胞的影响，我们开发了一种体外方法，用于在弹性膜上培养的贴壁细胞施加单轴循环拉伸应变。该方法采用一种定制设计的生物反应器，通过电机驱动的凸轮-转子系统施加所需的力。本文提供了一个逐步视频操作指南，演示如何组装每个“拉伸室”的各个组件，其中包括一个具有微图案化表面形貌的硅胶膜，以使细胞沿拉伸方向排列。我们还描述了拉伸室的灭菌步骤、细胞在膜上的接种、将拉伸室固定到生物反应器中的方法，以及调整机械参数（即应变的大小和频率）的操作流程。本操作方案中所述步骤特别针对在具有10 µm宽、且平行于拉伸方向排列的微通道硅胶膜上接种人源间充质干细胞。然而，该系统所采用的方法和材料具有足够的灵活性，可适应多种实验条件的变化：应变速率、应变幅度、作用时间、细胞类型、膜表面形貌、膜涂层等均可根据具体实验需求或目标进行调整。这是一种稳定可靠的体外研究单轴拉伸应变对细胞影响的方法。

方案

第0天 - 实验前的灭菌

1. 将材料放入塑料容器中，并用70%酒精消毒2小时：
   • 腔室
   • 盖子
   • 框架（全部3个部件）
   • 螺丝
   • 橡胶垫圈
   • 镊子
   • 剪刀
   • 六角扳手
2. 用Aquet肥皂和蒸馏水清洗膜。
3. 将膜在70%酒精中进行超声处理10分钟。
4. 将清洁后的膜放入塑料方皿中。若使用带有图案的膜，请确保图案面朝上（向膜的一侧喷洒酒精，观察液体是否沿沟槽流下）。
5. 将膜浸泡在70%酒精中，静置2小时。
6. 将手套用铝箔纸包好，准备次日早晨高压灭菌。
7. 用蒸馏水配制2%（质量/体积）明胶溶液（2 g/100 mL），用于次日高压灭菌。
8. 在70%酒精中完成2小时灭菌后，将所有聚合物材料和膜（不可高压灭菌的材料）放入超净台中进行过夜紫外照射：
   • 腔室
   • 盖子
   • 框架（全部3个部件）
   • 膜
9. 将剩余材料装入可高压灭菌的袋子中：
   • 螺丝
   • 橡胶垫圈
   • 镊子
   • 剪刀
   • 六角扳手

第1天 - 拉伸室的组装

1. 使用小型高压灭菌器在 240°F 下对镊子、剪刀、六角扳手、螺丝、垫圈、手套和明胶进行高压灭菌，总时长 20 分钟
2. 从紫外线下取出膜并用 O 处理₂ 等离子体（图案面朝上）处理约1分钟。
3. 在组织培养罩内，用明胶覆盖经等离子处理膜的图案化区域。在紫外线下孵育30分钟。
4. 用 PBS 洗涤每张膜 2 次。洗涤后 第二次洗涤后，保留一些 PBS 在膜上以保持其润滑，便于装入孵育腔。 （也可用此 PBS 润滑垫圈，以方便组装）。
5. 将膜组装入腔室（组装时佩戴经高压灭菌的手套）
   1. 使用单个螺丝连接框架的两个主要部件。
   2. 翻转 将膜放置在框架上方，使明胶涂层面向框架（图案区域应位于中央）。
   3. 使用垫圈将膜固定在框架的每一侧。
   4. 使用均匀且轻柔的压力将垫圈压入，以免撕裂膜。
6. 将组装好的框架连接到T型杆上。
7. 将框架翻转并倒置放入腔室中。对框架和膜的背面进行紫外线照射30分钟
8. 再次翻转框架，并将其拧入培养室（对照室无需更改，但对于拉伸室，需使用两颗螺丝将框架的端部固定到培养室底部，并移除连接框架两部分的单颗螺丝）。将正面进行紫外线照射30分钟。确保膜完全干燥后再进行下一步操作，否则在接种细胞时溶液可能会滑脱。
9. 种子细胞。1个培养板的面积等于3个膜的面积，因此每张膜使用1/3个汇合度为100%的培养板。每张膜加入1 mL细胞悬液。超过1.5 mL将难以使液体保留在膜上。仅将细胞悬液加至有图案的区域，并用移液器枪头将液体均匀铺开。盖上培养室，于生物安全柜中室温孵育30分钟，使细胞贴壁。
10. 将培养 chamber 转移至培养箱，使细胞贴壁 1 小时。转移 chamber 时务必格外小心，避免细胞悬液滑落！若此时溶液脱落，该 chamber 中的细胞将被完全破坏。
11. 将培养皿放回超净台，加入 20 mL 培养基。
12. 将培养室置于用酒精清洁过的容器中，容器表面覆盖铝箔（铝箔也需喷洒酒精）。将培养室转移至拉伸培养箱（10% CO₂）中。₂).
13. 将培养 chamber 固定到拉伸装置中。让细胞继续贴壁过夜，次日开始进行拉伸处理。注意将培养 chamber 放入拉伸仪器时，务必在放置 chamber 前将仪器锁定在“零”位置，然后拧紧齿轮周围的橡胶带；启动仪器前切记解锁齿轮。

讨论

Banes 等人首次报道了使用一种通过柔性弹性基底向细胞传递机械力的系统，用于体外细胞的机械刺激¹。自此以后，该设计的多种变体被提出并应用。目前市面上有多种名为“Flexercell”（Flexcell International Corp.）的机械拉伸系统，而一些实验室则使用自行构建的装置。在本视频方案中，我们描述了本实验室所使用的一种此类装置的安装与操作方法。

本方案中所示的自行设计“拉伸装置”已在多项研究中用于探究单轴循环应变对不同类型细胞的影响^2,3。该装置是一种多功能设备，具有多个可调节参数，适用于多种机械应变研究。本文所示的设置代表了一种独特且可靠的向培养中的贴壁细胞施加单轴循环应变的方法。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
两性霉素B	试剂	Lonza公司	17-836R	分装浓度为250 µg/mL，100倍储存液，保存于-20°C。
卡那霉素	试剂	Life Technologies旗下GIBCO公司	15160-054	终浓度为50 µg/mL。储存液配制为10 mg/mL，保存于-20°C。
庆大霉素	试剂	Lonza公司	17-518Z	终浓度为50 µg/mL。1000倍储存液配制为50 mg/mL，保存于-20°C。
青霉素/链霉素（Pen/Strep）	试剂	Life Technologies旗下GIBCO公司	15140-122	终浓度为1%。（也可从其他公司采购）
Dulbecco’s改良Eagle’s培养基	试剂	Life Technologies旗下GIBCO公司	11966-025
培养基说明：由于生物反应器装置较为复杂，这些单轴拉伸实验容易发生污染。为防止污染，我们尝试了多种抗生素和抗真菌剂的组合。通常必须使用1%的两性霉素B，并联合使用一种抗生素组合。可选用青霉素/链霉素组合，或选用卡那霉素与庆大霉素组合（但切勿同时使用三种或以上抗生素的混合物，以免导致耐药突变菌株的产生，并可能对细胞造成不利影响）。