评估无菌 C. elegans 中的肠道细菌定植

摘要

来源： Taylor, M. N., 等。 利用单条线虫数据量化异质性 秀丽隐杆线虫- 细菌相互作用 视频实验杂志 (2022)

本视频展示了将无菌且年龄匹配的Caenorhabditis elegans线虫暴露于一种细菌菌株以实现肠道定植的过程。视频详细说明了如何选择性去除未黏附及外部的细菌，仅保留黏附在肠道上皮上的可存活细菌，以便进行定量分析。

方案

1. 在液体培养基中用活细菌喂养线虫

注意：本方案用于在液体培养条件下，使线虫与实验室培养的细菌在充分混匀的环境中定植。线虫可定植单一纯培养分离菌（例如，Enterococcus faecium等病原菌），也可定植多种分离菌的混合物（例如，简化微生物组群落）。

1. 从15 mL锥形管中含蔗糖洗涤的同步化成虫开始，用12 mL S缓冲液洗涤虫体一次，弃去上清液。
2. 将洗涤后的线虫重悬于实验所需体积的S培养基中。需考虑实验条件的体积、线虫将被分配到的条件数量，以及线虫和细菌的最终浓度。
   注意： 线虫的摄食行为随细菌的可获得性而变化，且高密度饲养可使其产生应激。对于液体培养中的定植实验， <1000 条蠕虫/毫升以及 >10⁷ 建议使用 CFU/mL；10¹¹ CFU/mL 被认为是“随意摄取饲养密度对 E. coli.
3. 离心细菌培养物。倒去上清液；对于形成松散沉淀的细菌，可使用抽吸或移液方式去除上清液。
   注意： 用于培养 >5 mL，转移至15 mL离心管中，以约2800 x g 在大型台式离心机中离心8–10分钟。培养物 <5 mL 可转移至 1.5 mL 离心管中，在 9000 x g 条件下离心 g 在小型台式离心机中离心1-2分钟。高度运动性的细菌（例如，许多种类的） 假单胞菌可能需要在 4 °C 下冷却 10–15 分钟以促进形成稳定的沉淀，且在 4 °C 下离心效果更佳。
4. 将菌液用等体积的 S 缓冲液重悬，再次离心以形成沉淀。弃去上清液，处理方法同前。
5. 将细菌培养物重悬于S培养基中，调整至实验所需的密度，并加入用于筛选的抗生素（如有）。所用抗生素种类取决于用于定植的细菌的抗性谱。
6. 使用经含0.01% Triton X-100的M9线虫缓冲液（M9TX-01）润洗的移液枪头，轻柔吹打线虫，直至线虫在S培养基中充分重悬，随后转移至离心管或培养板孔中进行细菌定植。
7. 将细菌悬液加入每份线虫培养物中，以达到所需的细菌浓度和终体积。
8. 若使用多孔板进行定植，需用无菌的96孔透气密封膜覆盖板孔。
9. 在200 rpm条件下振荡孵育，以防止细菌在孵育过程中沉降。

2. 以96孔板格式对单条蠕虫进行机械破碎

注意：本部分描述了一种采用96孔板格式对单个细菌定植的C. elegans进行机械裂解的实验方案。该方案的初始步骤介绍了一种通过低温麻痹和表面漂白法去除虫体肠道内非黏附细菌并清洁线虫体表的方法。这些步骤可获得洁净且存活的成虫线虫，可用于机械裂解以定量分析其内含细菌，或用于后续实验。本方案可适用于定量分析在液体培养基、琼脂平板上、或自然环境及微宇宙土壤中定植的线虫体内的细菌。

1. 将 M9TX-01 分装样品置于冰上预冷（体积为样品数量的 4–5 倍，单位为 mL）。
2. 准备一份含次氯酸钠（6% 次氯酸钠，体积比 1:1000 或 1:2000）的 M9TX-01 分装液（每份样品 1 mL，另加 1 mL 备用），并置于冰上预冷。
3. 在 1.5 mL 微量离心管中，用 1 mL M9TX-01 重悬每个线虫样品。
4. 在低速迷你离心机中短暂离心（2–3 秒，2,000 × g，25 °C），使成虫沉淀。用移液器吸除上清液并弃去，注意不要扰动线虫沉淀。
5. 通过离心，先后用 1 mL M9TX-01 洗涤线虫两次，再用 1 mL M9 线虫缓冲液洗涤一次，以减少外部细菌。
6. 清除线虫肠道内未黏附的细菌。
   1. 在培养管中，用 1 mL S 培养基加 2 倍量热灭活 OP50 重悬每份线虫样品。
   2. 在 25 °C 下孵育 20–30 分钟，使肠道中未黏附的细菌排出。
      注意：此步骤还可清除肠腔内的胞外荧光蛋白，尤其在使用抗酸性荧光染料（如 mCherry、dsRed）时，有助于更清晰地观察黏附于肠上皮的标记细菌。
7. 对线虫进行表面漂白处理以清除外部细菌。
   1. 用 1 mL 冰冷的 M9TX-01 将已清洗的线虫洗涤两次，并弃去上清液。
   2. 将离心管置于冰上（优先选择）或 4 °C 冰浴 10 分钟，以麻痹线虫并防止其摄入漂白液。
      注意：其他方案可能使用左旋咪唑等化学麻痹剂；该方法虽已建立，但会引入有害废弃物处理问题。
   3. 向每根离心管中加入 1 mL 冰冷的 M9 线虫缓冲液和无香料漂白剂（8.25% 氢氧化钠，体积比 1:1000 或 1:2000）。将离心管置于冰上（优先选择）或 4 °C 至少 10 分钟，以杀灭外部细菌。
      注意：漂白剂浓度不得超过 1:1000。即使线虫已被麻痹，过高浓度仍可能导致死亡。
   4. 用移液器吸除漂白缓冲液并弃去；将离心管放回冰上，确保线虫在漂白剂完全清除前不会恢复吞咽活动。
   5. 向每根离心管中加入 1 mL 冰冷的 M9TX-01。在迷你离心机中离心约 5 秒（2,000 × g，25 °C）；然后将离心管放回冰上。吸除上清液并弃去。
   6. 再用 1 mL 冰冷的 M9TX-01 重复洗涤一次，尽可能弃尽上清液。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
漂白剂，商用，8.25% 次氯酸钠	Clorox
二水合氯化钙	Fisher Scientific	AC423525000
胆固醇	VWR	AAA11470-30
一水合柠檬酸	Fisher Scientific	AC124910010
五水合硫酸铜(II)	Fisher Scientific	AC197722500
Corning 6765 LSE 小型微量离心机	Corning	COR-6765
Eppendorf 1.5 mL 微量离心管，自然色	Eppendorf
Eppendorf 5424R 微量离心机	Eppendorf	5406000640	24 孔制冷台式微量离心机
Eppendorf 5810R 离心机，配 S-4-104 转子	Eppendorf	22627040	3L 台式离心机，配有适用于 15–50 mL 管和板的适配器
Eppendorf 板桶（x2），用于转子 S-4-104	Eppendorf	22638930
乙醇 100%	Fisher Scientific	BP2818500
七水合硫酸亚铁(II)	Fisher Scientific	423731000
七水合硫酸镁	Fisher Scientific	AC124900010
四水合氯化锰(II)	VWR	470301-706
蛋白胨	Fisher Scientific	BP1420-500
磷酸盐缓冲液 (1X PBS)	Gold Bio	P-271-200
聚丙烯自动灭菌托盘，浅型	Fisher Scientific	13-361-10
氢氧化钾	Fisher Scientific	AC134062500
磷酸氢二钾	Fisher Scientific	BP363-1
磷酸二氢钾	Fisher Scientific	BP362-1
勺型金属实验室刮勺	VWR	470149-438
氢氧化钠	VWR	BDH7247-1
无水磷酸氢二钠	Fisher Scientific	BP332-500
氯化钠	Fisher Scientific	BP358-1
一水合三柠檬酸三钾	Fisher Scientific	AC611755000
吐温 X-100	Fisher Scientific	BP151-100
七水合硫酸锌	Fisher Scientific	AC205982500