机械破碎单条线虫以评估宿主-细菌相互作用的变异性

摘要

来源： Taylor, M. N. 等 利用单条线虫数据量化异质性 秀丽隐杆线虫- 细菌相互作用 视频实验杂志 (2022)

本视频展示了通过机械裂解法对单个秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）肠道内细菌载量的变异性进行定量分析。视频详细介绍了样品制备、机械裂解、梯度稀释和菌落计数等步骤，用于评估个体线虫之间肠道细菌载量的差异。

方案

1. 将线虫分装至含有碳化硅颗粒的深孔96孔板中，用于机械破碎。按以下步骤制备96孔破碎板。
   1. 取一个无菌的2 mL深孔96孔板及配套的硅胶96孔板盖。
      注意：必须使用与组织破碎仪的96孔适配器兼容的板。外部尺寸的微小差异可能导致板无法从适配器中取出。
   2. 使用无菌刮铲，向每个将要加入线虫的孔中加入少量无菌的36目碳化硅颗粒。加入的量应刚好覆盖孔底（约每孔0.2 g）。过多的颗粒会导致移液时吸头难以触及孔底，从而影响内容物的回收。
   3. 向每个孔中加入180 µL M9线虫缓冲液。
   4. 标记列或行，以标明每个样本的位置，然后用硅胶96孔板盖轻轻盖住板。
2. 将单个线虫转移至96孔板中进行破碎。
   1. 小心地将透化处理后的线虫转移至一个小型（35或60 mm）培养皿中，该培养皿内含有足量添加了0.01% Triton X-100的M9线虫缓冲液（M9TX-01），液面深度约为1 cm。
      注意：如果线虫数量较多，可能无法一次性转移全部样本，因为液体空间会过于拥挤，难以逐个移取单个线虫。
   2. 使用解剖显微镜或其他低倍放大设备，以20 µL体积吸取单个线虫，并将其转移至96孔板的各个独立孔中。
      注意：最好仅收集刚死亡的线虫。避免选择呈僵直线状的线虫，因其可能已死亡较长时间。应尽量选择呈弯曲状或S形、具有正常宏观生理形态且肠道完整的线虫。
   3. 每次转移后，需确认目标线虫确实已被排入孔中。为此，从培养皿的清晰区域吸取20 µL M9TX-01，再将全部液体重新释放回培养皿中；若线虫粘附在吸头上，通常会在此过程中被排出。如果发现线虫仍粘附在吸头上，则从对应孔中移除20 µL液体，并重新尝试转移。
   4. 所有线虫转移完成后，用市售的柔性背纸密封膜（2 x 2方格）覆盖96孔板，确保密封膜的背纸面向下接触样本孔。注意不要将密封膜拉得过薄，否则后续难以移除。
   5. 将硅胶密封垫轻轻置于柔性密封膜上方；此时不要将盖子压入孔中。
   6. 将板转移至4 °C环境中预冷30–60分钟，以防止破碎过程中过热而损伤样本。
      注意：此为本实验流程中的暂停点。大多数情况下，板可在4°C下存放最多4小时后再进行研磨。切勿将线虫过夜存放，否则会影响细菌计数结果。
3. 将96孔板装载到组织破碎仪上，破碎线虫组织并释放肠道细菌。
   注意：（可选）若用于消化的96孔板数量为奇数，则需在开始前准备一个配重板。使用一个空的深孔96孔板，并向其中加水，直至其重量与第一个板相同。
   1. 将硅胶密封垫用力压入各孔中以形成密封，确保盖子在整个板表面平整贴合。
      注意：若柔性密封膜在拉伸后过厚，则难以使硅胶盖完全平整地压入所有孔中，这将导致密封不充分，并在震荡过程中引起孔间污染。
   2. 使用96孔板适配器将板固定在组织破碎仪中。以30 Hz频率震荡1分钟，然后将板旋转180°，再次震荡1分钟。此操作有助于确保板内所有孔中的组织破碎均匀。
   3. 将板在实验台面上用力敲击两到三次，以震落附着在柔性密封膜上的颗粒。
   4. 使用配备两个96孔板适配器的大容量离心机，以2400 x g离心2分钟，使所有物质沉降至孔底。
   5. 移除硅胶盖，并小心撕下柔性密封膜。
      注意：若柔性密封膜在某些孔中粘连，可用200 µL移液吸头将其取下。此情况常发生在密封膜被过度拉伸变薄时。
4. 在96孔板中对线虫消化液样本进行连续稀释，每孔总体积为300 µL。
   1. 使用多通道移液器设定为200 µL，缓慢而仔细地反复吹打数次以重新混匀孔内内容物，然后尽可能多地吸取液体。将该液体转移至预先准备用于连续稀释破碎后线虫样本的96孔板的最上排孔中。
   2. 使用设定为20 µL的96通道移液器，从最上排孔中吸取该体积液体并分配至B排。上下吹打8–10次以混匀。弃去吸头。
   3. 重复步骤4.2，从B排的0.1倍稀释样本开始，制备C排的0.01倍稀释样本。
   4. 再次重复步骤4.2，从C排转移至D排。
   5. 将稀释后的样本点种于固体琼脂平板上，用于细菌定量。对于单菌定植的线虫，通常只需在琼脂平板上点加每个稀释度（1x–0.001x）的10–20 µL液滴即可。对于多物种定植的情况，应分别点种每个稀释度：用移液器将100 µL样本加至10 cm琼脂平板上，并立即使用玻璃涂布珠均匀涂布。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
96孔板硅胶密封垫，方形孔（AxyMat）	Axygen	AM-2ML-SQ
96孔板，2 mL，方形孔	Axygen	P-2ML-SQ-C-S
96孔聚丙烯板盖	Evergreen Labware	290-8020-03L
琼脂	Fisher Scientific	443570050
用于96孔板的珠磨适配器套装	QIAGEN	119900	与TissueLyser II配合使用，可同时处理两个96孔板的适配板
珠磨式组织匀浆仪（TissueLyser II）	QIAGEN	85300	适用于中高通量样本破碎的机械匀浆设备
Breathe-Easy 96孔透气密封膜	Diversified Biotech	BEM-1	多孔板用透气型聚氨酯膜。薄膜薄而透氧，允许O₂、CO₂和水蒸气透过，且在波长低至300 nm时仍具有紫外透光性。无菌，每盒100片。
Eppendorf 5810R离心机，配备S-4-104转子	Eppendorf	22627040	3L台式离心机，配有适用于15–50 mL离心管和板的转子适配器
Eppendorf板用吊篮（x2），适用于S-4-104转子	Eppendorf	22638930
培养皿，圆形，10 cm	VWR	25384-094