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1. 点/ICM分量极性定位和动力学的量化
注意： 以下步骤是针对通过 2 x 2 合并获取的每像素 0.129 μm 的图像而设计的。
- sfGFP（超文件夹绿色荧光蛋白）融合蛋白的极性定量（图1）
- 调整图像对比度，使细菌清晰可见。使用区域工具放置一个 0.25 x 1.3 μm2 矩形，从极点开始并延伸到细胞质中。矩形必须精确地保持在细菌边界内。
- 标记至少 200 个细菌，并使用“ 要掩蔽的区域 ”按钮为感兴趣区域创建掩模。在 “掩码统计量 ”和“ 掩码范围”下，选择 “对象”。然后，在 特征 和 强度下，标记 平均强度 和 方差。
- 导出数据并计算每种细菌的极性分数，作为方差与平均强度之间的比率。
- 对于高通量应用，使用相位物镜和适当的聚光镜设置来采集具有相位和 488 nm 通道的图像。确保选择细菌完全分离的视野。
- 将图像的相位通道对比度调整到细菌清晰可见的水平。打开双通道图像，启动“ 创建段遮罩 ”窗口，并将通道更改为相位。
- 调整适当的阈值并使用“ 定义对象” 按钮删除小对象。在 “优化蒙版”下， 选择 “删除边缘对象”， 然后分离彼此相邻的细菌蒙版。
- 计算每个细胞的 488 通道中信号的极性分数，如前面的步骤 1.1.2–1.1.3 中所述。
- sfGFP 融合蛋白动力学的定量（图 2）
注意： 动力学定义为强度随时间的变化，以下步骤专为短成像周期（即几分钟）而设计。如果需要更长的成像时间，请在垫子中添加适当的补充剂。- 在“图像捕获”窗口中，标记延时摄影，在间隔框中输入间隔时间，然后在时间点 # 框中输入 2。获取表达目标荧光蛋白的嗜肺军团菌的两张连续图像。
- 调整图像对比度，直到单元格清晰可见。按照 图 2A 和下面的说明放置三个不同的掩模。使用区域工具将 0.25 x 0.25 μm 的正方形放置在至少 400 个细胞的中间。
- 使用“ 要遮罩的区域 ”按钮创建感兴趣方块的遮罩（遮罩 1）。创建一个新的空掩码（掩码 2），并使用像素工具或多边形工具标记至少 25 个随机单元格的整个单元格区域，这些区域将用于计算荧光漂白。创建一个新的空蒙版（蒙版 3）并使用大画笔工具标记单元格之间的区域，这将用于背景减法。
- 在“ 掩膜统计量 ”和“ 掩膜范围”下，为掩膜 1 和掩膜 2 选择 “对象” 。然后，在 “特征 和 强度”下，选择 “平均强度” 并导出两个掩膜的数据。对于蒙版 3，导出整个蒙版的平均强度。
- 使用以下公式计算掩模 1 中每个物体的荧光强度变化：
其中掩模 1 是放置在细胞中心的 0.25 μm × 0.25 μm 正方形，掩模 2 覆盖整个细胞，掩模 3 是细胞之间的背景，T1 是第一个时间点的平均强度，T2 是第二个时间点的平均强度。
