量化 Legionella pneumophila 分泌系统组分的极性与动态性

摘要

来源： Chetrit, D., 等结合活细胞成像与冷冻电子断层扫描技术解析细胞时空动态特征 嗜肺军团菌 Dot/Icm 分泌系统 视频实验杂志 (2020)

本视频展示了利用活细胞荧光成像技术定量分析嗜肺军团菌（Legionella pneumophila）分泌系统组分的极性与动态行为，从而实现对空间募集及胞质重分布过程的分析，这对于理解细菌致病机制至关重要

方案

1. Dot/Icm 组分极性定位及其动态的定量分析

注意：以下步骤适用于以 2 x 2 binning 模式采集、每个像素对应 0.129 µm 的图像。

1. sfGFP（超折叠绿色荧光蛋白）融合蛋白极性定量分析（图1）
   1. 调整图像对比度，使细菌清晰可见。使用区域工具在极性位置放置一个0.25 × 1.3 µm²的矩形，并延伸至细胞质内。该矩形必须精确位于细菌边界之内。
   2. 标记至少200个细菌，并点击区域转掩膜按钮，为感兴趣区域创建掩膜。在掩膜统计和掩膜范围中选择对象；然后在特征和强度中勾选平均强度和方差。
   3. 导出数据，并将每个细菌的极性评分计算为方差与平均强度的比值。
   4. 对于高通量应用，使用相差物镜和适当的聚光镜设置，同时采集相差通道和488 nm通道的图像。确保选择细菌完全分离的视野。
   5. 调整图像相差通道的对比度，使其达到细菌清晰可见的水平。打开双通道图像，启动创建分割掩膜窗口，并将通道切换至相差通道。
   6. 设置合适的阈值，并使用定义对象按钮去除小物体。在优化掩膜中选择去除边缘对象，随后将彼此相邻的细菌掩膜分离开。
   7. 按照步骤1.1.2–1.1.3中所述方法，计算每个细胞在488 nm通道信号中的极性评分。
2. sfGFP融合蛋白动态性定量分析（图2）
   注意：动态性定义为随时间变化的强度变化，以下步骤适用于短时间成像（即数分钟）。若需更长时间成像，请在培养基中添加适当的补充成分。
   1. 在图像采集窗口中勾选时间序列，在间隔框中输入时间间隔，并在时间点数量框中输入2。连续采集表达目标荧光蛋白的Legionella pneumophila的两幅图像。
   2. 调整图像对比度，直至细胞清晰可见。参照图2A及以下说明，放置三种不同的掩膜。使用区域工具在至少400个细胞的中央放置一个0.25 × 0.25 µm的正方形。
   3. 点击区域转掩膜按钮，为这些正方形区域创建掩膜（掩膜1）。新建一个空掩膜（掩膜2），使用像素工具或多边形工具标记至少25个随机细胞的整个细胞区域，用于计算荧光漂白。再新建一个空掩膜（掩膜3），使用大号画笔工具标记细胞之间的区域，用于背景扣除。
   4. 在掩膜统计和掩膜范围中，对掩膜1和掩膜2选择对象；然后在特征和强度中选择平均强度，并导出这两个掩膜的数据。对于掩膜3，导出整个掩膜的平均强度。
   5. 使用以下公式计算掩膜1中每个对象的荧光强度变化：

其中，掩膜1是位于细胞中心的0.25 µm × 0.25 µm的正方形区域，掩膜2覆盖整个细胞，掩膜3是细胞之间的背景区域，t1是第一个时间点的平均荧光强度，t2是第二个时间点的平均荧光强度。

结果

图1：Dot/Icm系统亚基极性定位的定量分析。（A）在Lp01中表达的DotB-sfGFP的实时成像显示其具有极性定位。当DotB-sfGFP在dot/icm基因簇完全缺失的菌株中表达时（∆T4SS），呈现弥散分布模式。从dotB...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
100x Plan Apo 物镜（1.4 NA）	Nikon
CoolSNAP EZ 20 MHz 数字黑白相机	Photometrics
显微镜盖玻片 22x22 mm	Fisher Scientific	12-542B
显微镜盖玻片 24x50 mm	Fisher Scientific	12-545K
显微镜载玻片 25x75x1 mm	Globe Scientific	1380
SlideBook 6.0	Intelligent Imaging Innovations
Spectra X 光源系统	Lumencor