培养快速生长的细菌 Vibrio natriegens

摘要

来源：Wiegand, D. J., Lee, 等, 利用快速生长的细菌Vibrio natriegens进行无细胞蛋白表达。 J. Vis. Exp. (2019)

本视频展示了在通气条件下培养和收获快速生长的细菌——Vibrio natriegens，以制备用于粗提物生成的菌体沉淀。

方案

制备Vibrio natriegens 粗细胞提取物——细菌培养

1. 准备 V. natriegens 细菌培养基 LB-V2（含 V2 盐的溶菌肉汤） 表1. 使用高压灭菌法对培养基进行灭菌。待培养基冷却至室温（RT）。将多余的培养基在室温（RT）下储存。
   警告： 穿戴适当的个人防护装备（PPE），操作高压灭菌器时应查阅实验室特定的操作规程。
2. 使用野生型甘油菌种 V. natriegens 接种3 mL LB-V2培养基，在30 °C、225 rpm振荡条件下过夜培养。
3. 通过在 10,600 x g 条件下离心，洗涤 1 mL 过夜培养物 g 在台式离心机中离心1分钟。吸取上清液，注意不要扰动形成的沉淀，然后将沉淀重悬于1 mL新鲜LB-V2培养基中。
4. 在已灭菌的4 L挡板锥形瓶（带无菌盖）中加入1 L新鲜LB-V2培养基。接种1 mL洗涤后的过夜培养物（接种比例为1:1,000）。在30 °C、225 rpm振荡条件下培养。
   注意： V. natriegens 培养物可在保持1:1,000稀释比例的前提下进行放大或缩小。例如，将250 μL洗涤后的过夜培养物加入装有250 mL新鲜LB-V2培养基的2 L带挡板锥形瓶中，瓶口覆盖无菌盖。
5. 监测培养物的OD₆₀₀ 使用分光光度计。当培养物达到 OD₆₀₀ = 1.0 ± 0.2，通过在 3,500 x g 4 °C下离心20分钟。将沉淀置于冰上。
   注意： V. natriegens 生长迅速，因此必须密切监测培养物。生长至 OD₆₀₀ 1.0 在 1:1,000 稀释比例下应耗时约 1.5−2 小时。
6. 吸弃上清液，立即将所得的细菌沉淀在 -80 °C 保存，或直接进行细胞裂解。
   注意： 此步骤适合暂停操作；但为获得最佳效果，建议立即或在1−2天内尽快处理沉淀物。

表1：制备1 L LB-V2细菌培养基的试剂

表1 A	LB-V2 细菌培养基的配制
组分	用量 (g)	终浓度 (mM)	终体积 (L)
LB 肉汤（Miller）	25		1
NaCl	11.69	200
MgCl2	2.20	23.1
KCl	0.31	4.2
表1 B	S30A 裂解缓冲液的配制
组分	用量 (g)	终浓度 (mM)	终体积 (L)
Tris 溶液 (pH 8.0) - 1 M (mL)	25	50	0.5
Mg-谷氨酸盐	2.72	14
K-谷氨酸盐	6.10	60
二硫苏糖醇 (DTT) - 1 M (mL)	1	2

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2 mL 离心管	Eppendorf	22363352
HEPES（4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸）	Sigma	H3375
LB（Luria-Bertani）培养基（Miller 型）	Sigma	L3522
氯化镁（MgCl₂）	Sigma	M8266
氯化钾（KCl）	Sigma	P9333
氯化钠（NaCl）	Sigma	S7653
Tris 溶液（pH 8.0）- 1 M	Invitrogen	AM9856
Vibrio natriegens（野生型）冻干菌种	ATCC	14048