Vibrio natriegens 粗提细胞裂解液的制备

摘要

来源： Wiegand, D. J., 等人无细胞蛋白表达利用快速生长的细菌 Vibrio natriegens 视觉实验杂志. (2019).

本视频演示了从生长迅速且以高蛋白合成速率著称的细菌Vibrio natriegens中制备细胞提取物的过程。将细菌沉淀洗涤后重悬于裂解缓冲液中，并在冰上进行超声处理，以防止细胞降解。裂解液经离心以去除不溶性细胞碎片，收集上清细胞提取物，快速冷冻后储存以备后续使用。

方案

1. 制备V. natriegens 粗细胞提取物——细菌培养

1. 准备 V. natriegens 细菌培养基，按LB-V2（Lysogeny Broth版本2）配方 表1. 使用高压灭菌器对培养基进行灭菌。待培养基冷却至室温（RT）。将多余的培养基在室温（RT）下储存。
   注意： 穿戴适当的个人防护装备（PPE），操作高压灭菌器时应查阅实验室特定的操作规程。
2. 使用野生型甘油菌种 V. natriegens 接种3 mL LB-V2培养基，30℃过夜培养 °225 rpm 摇床培养。
3. 通过在 10,600 x g 条件下离心，洗涤 1 mL 过夜培养物 g 在台式离心机中离心1分钟。吸取上清液，注意不要扰动形成的沉淀，然后将沉淀重悬于1 mL新鲜LB-V2培养基中。
4. 在已灭菌的4 L带挡板锥形瓶中加入1 L新鲜LB-V2培养基，并用无菌盖密封。取1 mL经洗涤的过夜培养物（按1:1,000比例稀释）接种。于30 °C培养 °225 rpm 振荡条件下，于 C 中培养。
   注意： V. natriegens 培养物可在保持1:1,000稀释比例的同时进行放大或缩小。例如，加入250 μ将洗涤后的过夜培养物取适量加入至装有250 mL新鲜LB-V2培养基的2 L挡板锥形瓶中，使用无菌封口膜封口。
5. 监测培养物的OD₆₀₀ 使用分光光度计。当培养物达到 OD₆₀₀ = 1.0 ± 0.2，通过3,500 x g离心收集培养物 g 4℃下孵育20分钟 °C. 将沉淀置于冰上。
   注意： V. natriegens 生长迅速，因此必须密切监测培养物。生长至OD₆₀₀ = 1.0 在 1:1,000 稀释比例下应耗时约 1.5−2 小时。
6. 吸弃上清液，并立即将所得的细菌沉淀在 -80 ℃ 保存 °C 或直接进入第 2 节所述的细胞裂解步骤。
   注意： 此步骤适合暂停操作；但为获得最佳结果，建议立即或在1−2天内尽快处理沉淀物。

2. 准备 V. natriegens 粗细胞提取物——细胞裂解

1. 按如下方法配制 S30 裂解缓冲液 表1 在无菌去离子水（DI水）中溶解，并用冰醋酸调节pH至7.7。
   警告： 调节pH时应使用适当的个人防护装备（PPE）处理冰醋酸。
2. 将S30裂解缓冲液冷却至约4 °在开始细胞裂解程序之前，将样品置于冰箱或冰上保持 4°C。
   注意： 为快速降温，可将裂解缓冲液置于 -20 °C. 不要让缓冲液结冰。
3. 将细胞沉淀置于冰上 10−20 分钟，或直至完全解冻。使用 10 mL 冷的 S30 裂解缓冲液重悬来自同一 1 L 培养物的所有沉淀，然后将悬液转移至 50 mL 离心管中。若沉淀未在 -80 °C 冰箱中冷冻保存 °在步骤1.6中，直接进行重悬。
   注意： 根据需要增加用于初始重悬沉淀的 S30 裂解缓冲液体积。
4. 3,500 × g 离心悬浮液 g 4℃下10分钟 °C. 吸去上清液，注意不要扰动沉淀。用10 mL冷的S30裂解缓冲液将沉淀再洗涤一次。将沉淀置于冰上。
5. 在低温室中，加入500 μ将冷的S30裂解缓冲液加入50 mL离心管中的沉淀中。使用宽口移液器吸头重悬沉淀，并小心地将全部沉淀悬液转移至2 mL离心管中。
   注意： 若无宽口移液器，可使用剪刀剪去1 mL移液器吸头末端，以增大孔径便于沉淀转移。
   1. 尽可能转移大部分沉淀，同时不显著增加体积；但应使用足量液体重悬沉淀，以便进行超声处理，以2 mL离心管中形成均一悬液为准。切勿过度填充2 mL离心管，悬液体积不应超过1.5 mL；必要时可分装至多个离心管中。
6. 将细胞沉淀置于冰上，并在冷室中操作。取一个600 mL烧杯装满冰，将2 mL离心管架放在冰上。.
   注意： 将试管架放置在烧杯旁边有助于观察冰中沉淀悬浮液的情况，以监测超声处理的进展（参见 图1).
7. 在2 mL离心管中短暂涡旋悬浮沉淀，以混匀细胞，轻弹管壁以去除管盖底部附着的细胞，随后将离心管放入管架中并打开管盖。将超声破碎仪探头插入悬浮液中，使其刚好位于液面下方。
8. 按照图示准备超声处理装置 图2 使用带有探头的超声波破碎仪 ⅛英寸尖端直径。将以下参数输入超声波破碎仪控制器：20 kHz 频率，50% 振幅，脉冲开启时间：10 s，脉冲关闭时间：60 s。
9. 运行脉冲超声处理程序，共三个循环。如果沉淀重悬液的总体积为 > 500 μL，运行脉冲超声处理程序六次。
   注意： 通常，3−6 次脉冲足以裂解 V. natriegens 沉淀物；根据超声波破碎仪的不同，可能需要额外的脉冲处理。在超声过程中，使用平台调节旋钮上下移动探头，以裂解可能沉降到管底的沉淀物。可在脉冲间隔将管子从支架上取下，短暂涡旋以重新均质化悬浮液。
   警告： 超声波破碎仪工作时，应佩戴适当的听力保护装置。
10. 超声处理后，将粗制细胞提取物在16,000 x g 4℃下孵育30−45分钟 °C，直至裂解液中无任何细胞碎片，如图所示 图3.
11. 在低温室中，分装 50 μ将所得上清液转移至新的 2 mL 管中，注意勿扰动沉淀。
    注意： 任何意外转移至新的2 mL离心管中的碎片都会显著降低提取物高效合成蛋白质的能力。
12. 通过将试管放入带有浸入式绳索的试管架中，对粗制细胞提取物进行速冻，如图所示 图4将试管浸入装有液氮的杜瓦瓶中，随后立即置于-80℃超低温冰箱中。 °C，直至使用。注意： 使用液氮时应穿戴适当的个人防护装备，包括实验服、护目镜、面罩、防冻围裙和手套。

表1：制备1 L LB-V2细菌培养基和0.5 L S30A细胞裂解缓冲液的试剂。

表1 A	LB-V2 细菌培养基的配制
组分	用量 (g)	终浓度 (mM)	终体积 (L)
LB 肉汤（Miller）	25		1
NaCl	11.69	200
MgCl2	2.20	23.1
KCl	0.31	4.2
表1 B	S30A 裂解缓冲液的配制
组分	用量 (g)	终浓度 (mM)	终体积 (L)
Tris 溶液 (pH 8.0) - 1 M (mL)*	25	50	0.5
Mg-谷氨酸盐	2.72	14
K-谷氨酸盐	6.10	60
二硫苏糖醇 (DTT) - 1 M (mL)*	1	2

结果

图1：超声平台上的烧杯和试管架的特写视图。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
15 mL 离心管	Corning	352196
2 mL 离心管	Eppendorf	22363352
50 mL 离心管	Corning	352070
杜瓦瓶 - 4L	ThermoScientific	10-194-100C
L-谷氨酸半镁盐四水合物	Sigma	49605
L-谷氨酸钾盐一水合物	Sigma	G1149
LB 培养基（Miller 型）	Sigma	L3522
氯化镁（MgCl₂）	Sigma	M8266
氯化钾（KCl）	Sigma	P9333
氢氧化钾颗粒	Sigma/Roche	1050121000
Q125 超声波破碎仪及 CL-18 探头	Qsonica	4422
氯化钠（NaCl）	Sigma	S7653
Vibrio natriegens（野生型）冻干菌种	ATCC	14048