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1. 无细胞反应组分的制备
- 通用反应组分
- 在50 mL离心管中，分别使用无菌去离子水配制浓度为100 mM和2000 mM的Mg-谷氨酸盐和K-谷氨酸盐工作液。
- 在250 mL烧杯中加入100 mL无菌去离子水，放入一小块磁力搅拌子。称取50 g PEG-8000，加入烧杯的100 mL水中，配制50% (w/v) 聚乙二醇（PEG）-8000工作液。
- 将烧杯置于设定为 100 °C 的加热磁力搅拌器上，以 250 rpm 搅拌，直至 PEG-8000 完全溶解。待 PEG-8000 液体混合物冷却后，转移至 50 mL 离心管中。
- 能量溶液主混合液
- 将140 g KOH颗粒加入500 mL无菌去离子水中，配制5 M的KOH溶液。
警告： 在通风橱中配制该溶液，操作强碱时需穿戴个人防护装备。溶液会产生热量，因此瓶盖应留有缝隙，以防止压力积聚。使用前让KOH溶液恢复至室温。 - 通过将20.85 g HEPES加入100 mL瓶中，配制1750 mM HEPES-KOH缓冲液。缓慢加入无菌去离子水，直至体积达到40 mL。涡旋振荡瓶体以溶解HEPES。使用5 M KOH溶液将pH值调节至8.0，然后将溶液定容至50 mL。
注意： 调节pH时应使用适当的个人防护装备（PPE）处理KOH。 - 按指定浓度配制剩余的10倍能量主混合物储备液组分 表1 在无菌去离子水中溶解，并将每种储备液置于冰上。在室温下解冻100 mM ATP、GTP、CTP和UTP储备液，然后置于冰上。
注意： 必要时可使用设定为37 °C和350 rpm的恒温混匀仪将试剂溶解于溶液中。切勿过热或将试剂在恒温混匀仪上放置过长时间。 - 在15 mL离心管中，按照指定的顺序和体积加入每种能量溶液主混合液组分 表1每次加入组分后涡旋振荡溶液。这将配制成5 mL的10倍能量溶液主混合液。
- 将10倍能量溶液主混合液分装至2 mL离心管中，每管200 μL。迅速冷冻每份分装液，并立即置于-80 °C冰箱中保存至使用。
- 氨基酸母液混合物
- 准备新鲜的4倍氨基酸母液时，首先在室温下解冻每种氨基酸储备液，然后置于冰上。使用涡旋振荡器和/或设置为37 °C、350 rpm的温控混合仪，确保所有氨基酸储备液完全溶解。
注意： 半胱氨酸可能无法完全溶解；可作为悬浮液加入氨基酸母液中。切勿过热，或使试剂在恒温混匀仪中长时间放置。 - 在15 mL离心管中，按以下顺序将适当体积的氨基酸加入无菌去离子水中，使每种氨基酸的终浓度均为8 mM：ALA、ARG、ASN、ASP、GLN、GLU、GLY、HIS、IIE、LYS、MET、PHE、PRO、SER、THR、VAL、TRP、TYR、LEU和CYS。每加入一种氨基酸后，涡旋混匀母液。所列体积见下表 表1 将配制2.4 mL氨基酸主混合液。
- 将4倍氨基酸母液分装至2 mL离心管中，每管200 μL。每管迅速冷冻后，立即置于-80 °C冰箱中保存至使用。
- 制备可直接用于反应的质粒DNA模板
注意： 该系统中无细胞蛋白表达已通过超级折叠绿色荧光蛋白（GFP）表达载体 T7-pJL1-sfGFP 进行优化（材料表）。建议将该质粒用作无细胞反应效率的对照，并将pJL1质粒骨架用于其他蛋白序列的克隆与表达。也可使用其他质粒DNA模板，但需注意转录由T7启动子序列及T7 RNA聚合酶的存在所控制。一种用于从转化菌株大规模制备任意质粒DNA模板的简易方案 E. coli 如下所述。- 使用质粒纯化试剂盒，按照制造商说明书纯化目标载体（材料列表）。注意：建议尽可能浓缩质粒DNA模板，以满足无细胞反应的严格体积限制。通常，工作液浓度应达到750−1500 ng/μL。
2. 使用V. natriegens粗提物进行无细胞蛋白质表达反应
- 使用质粒或线性DNA模板进行无细胞蛋白表达
- 从-80 °C冰箱中取出10x能量溶液主混合液和4x氨基酸主混合液，室温融化后置于冰上。从-20 °C冰箱中取出T7 RNA聚合酶和RNase抑制剂储备液，置于冰上。将DNA模板在室温下解冻后置于冰上。
- 按照表2所示，在冰上的2 mL离心管中依次加入以下组分，配制无细胞反应主混合液：氨基酸主混合液、能量溶液主混合液、Mg-谷氨酸盐、K-谷氨酸盐、DNA模板、PEG-8000、T7 RNA聚合酶和RNase抑制剂。每次加入后轻轻弹击管壁，使混合均匀。
注意：若使用线性模板进行无细胞蛋白表达，需加入比质粒模板多5−10倍的量，以获得可观测的蛋白产量。 - 从-80 °C冰箱中取出V. natriegens粗细胞裂解液，置于冰上10−20分钟，直至完全解冻。根据表2加入相应体积的粗细胞提取物至无细胞反应主混合液中，并通过轻弹或移液上下吹打的方式轻轻混匀。
- 使用PCR仪进行终点法无细胞蛋白表达
- 将10 μL无细胞反应主混合液移至96孔或384孔PCR板的孔底。每次转移后，轻轻弹击主混合液管以混匀。
注意：为最大程度保证各反应间的可重复性及所有样本中的无细胞蛋白表达水平，主混合液应始终保持充分混匀状态。
- 将PCR板短暂离心（1,000 x g，10秒），使附着在孔壁上的液体沉至孔底。用封板膜密封各孔以防止蒸发，随后将PCR板放入设定为26 °C、热盖温度为105 °C的PCR仪中。
注意：PCR仪均匀的热分布和加热热盖可显著提高蛋白表达产量。 - 将无细胞反应体系孵育至少3小时。孵育结束后，可对表达的蛋白进行纯化、定量，并用于后续实验。
注意：表达的蛋白可通过用户选择的方法在无细胞反应体系中直接定量。例如，荧光蛋白可使用外标标准曲线进行定量，若在无细胞反应中使用了放射性标记的氨基酸，则可测量放射性信号。通常不建议在未经过初步纯化的情况下，直接使用紫外-可见光谱法或总蛋白检测法测定无细胞反应中的蛋白产量。
表1：配制5 mL 10倍能量溶液主混合液和2.4 mL 4倍氨基酸主混合液所需的试剂。
| 10x 能量溶液母液的配制 | |
|---|
| 组分 | 储存浓度 (mM) | 终浓度 (mM) | 体积 (µL) | 终体积 (µL) |
| HEPES-KOH pH 8 | 1750 | 500 | 1428.57 | 5000 |
| ATP | 100 | 15 | 750.00 |
| GTP | 100 | 15 | 750.00 |
| CTP | 100 | 9 | 450.00 |
| UTP | 100 | 9 | 450.00 |
| 来自 E. coli MRE 600 的 tRNA (mg/mL)* | 100 | 2 | 100.00 |
| 辅酶 A 水合物 | 200 | 2.6 | 65.00 |
| NAD | 200 | 3.3 | 82.50 |
| cAMP | 650 | 7.5 | 57.69 |
| 亚叶酸 | 100 | 0.7 | 35.00 |
| 亚精胺 | 1600 | 10 | 31.25 |
| 3-PGA | 2000 | 300 | 750.00 |
| 无菌去离子水 | | | 49.99 |
| | 4x 氨基酸母液的配制 |
| 组分 | 储存浓度 (mM) | 终浓度 (mM) | 体积 (µL) | 终体积 (µL) |
| ALA | 168 | 8 | 114.3 | 2400 |
| ARG | 168 | 8 | 114.3 |
| ASN | 168 | 8 | 114.3 |
| ASP | 168 | 8 | 114.3 |
| GLN | 168 | 8 | 114.3 |
| GLU | 168 | 8 | 114.3 |
| GLY | 168 | 8 | 114.3 |
| HIS | 168 | 8 | 114.3 |
| IIE | 168 | 8 | 114.3 |
| LYS | 168 | 8 | 114.3 |
| MET | 168 | 8 | 114.3 |
| PHE | 168 | 8 | 114.3 |
| PRO | 168 | 8 | 114.3 |
| SER | 168 | 8 | 114.3 |
| THR | 168 | 8 | 114.3 |
| VAL | 168 | 8 | 114.3 |
| TRP | 168 | 8 | 114.3 |
| TYR | 168 | 8 | 114.3 |
| LEU | 140 | 8 | 137.1 |
| CYS | 168 | 8 | 114.3 |
| 无菌去离子水 | | | 91.4 |
表2：用于DNA模板的优化型V. natriegens无细胞反应主混合液组分
| 无细胞反应主混合液 | |
| 组分 | 储存浓度 (mM) | 终浓度 (mM) | 单次反应用量 (µL) | 50 次反应用量 (µL) |
| 提取物 (%) | | 25 | 2.50 | 125.00 |
| Mg-谷氨酸盐 | 100 | 3.5 | 0.35 | 17.50 |
| K-谷氨酸盐 | 2000 | 80 | 0.40 | 20.00 |
| 4x 氨基酸主混合液 | 8.0 | 2 | 2.50 | 125.00 |
| 10x 能量溶液主混合液 | | | 1.00 | 50.00 |
| 质粒 DNA (ng/µL) | 1000 | 500 | 0.50 | 25.00 |
| 50% PEG-8000 (%) | 50 | 2 | 0.40 | 20.00 |
| T7 RNA 聚合酶 | | | 1.00 | 50.00 |
| 鼠源 RNase 抑制剂 | | | 0.10 | 5.00 |
| 无菌去离子水 | | | 1.25 | 62.50 |
| 反应体积 (µL): | 10 | | | |