利用细菌粗提细胞提取物进行无细胞蛋白质表达

摘要

来源： Wiegand, D. J., 等 利用快速生长细菌进行无细胞蛋白表达 Vibrio natriegens 视频实验杂志 (2019).

本视频展示了利用基于Vibrio natriegens粗裂解液的细菌无细胞蛋白表达系统，进行体外偶联转录与翻译的技术。重点介绍了包含必要组分的主混合液的制备，以及从DNA模板逐步合成功能性蛋白的实验步骤。

方案

1. 无细胞反应组分的制备

1. 通用反应组分
   1. 在50 mL离心管中，分别使用无菌去离子水配制浓度为100 mM和2000 mM的Mg-谷氨酸盐和K-谷氨酸盐工作液。
   2. 在250 mL烧杯中加入100 mL无菌去离子水，放入一小块磁力搅拌子。称取50 g PEG-8000，加入烧杯的100 mL水中，配制50% (w/v) 聚乙二醇（PEG）-8000工作液。
   3. 将烧杯置于设定为 100 °C 的加热磁力搅拌器上，以 250 rpm 搅拌，直至 PEG-8000 完全溶解。待 PEG-8000 液体混合物冷却后，转移至 50 mL 离心管中。
2. 能量溶液主混合液
   1. 将140 g KOH颗粒加入500 mL无菌去离子水中，配制5 M的KOH溶液。
      警告： 在通风橱中配制该溶液，操作强碱时需穿戴个人防护装备。溶液会产生热量，因此瓶盖应留有缝隙，以防止压力积聚。使用前让KOH溶液恢复至室温。
   2. 通过将20.85 g HEPES加入100 mL瓶中，配制1750 mM HEPES-KOH缓冲液。缓慢加入无菌去离子水，直至体积达到40 mL。涡旋振荡瓶体以溶解HEPES。使用5 M KOH溶液....

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
15 mL 离心管	Corning	352196
2 mL 离心管	Eppendorf	22363352
384 孔黑色检测板	Corning	3544
384 孔 PCR 板	Eppendorf	951020702
50 mL 离心管	Corning	352070
96 孔 PCR 板	Eppendorf	30129300
腺苷 3',5'-单磷酸钠盐一水合物	Sigma	A6885
腺苷 5'-三磷酸 - 100 mM	NEB	N0450L
Applied Biosystems Veriti 384 孔热循环仪	ThermoFisher	4388444
检测板密封膜	BioRad	MSB1001
β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸水合物 (NAD)	Sigma/Roche	10127965001
辅酶 A 水合物	Sigma	C4283
胞苷 5'-三磷酸 - 100 mM	NEB	N0450L
D-(-)-3-磷酸甘油酸二钠盐 (3-PGA)	Sigma	P8877
杜瓦瓶 - 4 L	ThermoScientific	10-194-100C
二硫苏糖醇溶液 - 1 M	Sigma	42816
亚叶酸钙盐水合物	Sigma	47612
冰乙酸	Sigma	A6283
鸟苷 5'-三磷酸 - 100 mM	NEB	N0450L
HEPES	Sigma	H3375
L-谷氨酸半镁盐四水合物	Sigma	49605
L-谷氨酸钾盐一水合物	Sigma	G1149
氯化镁 (MgCl₂)	Sigma	M8266
质粒 pJL1-sfGFP	Addgene	69496
Plasmid Plus Maxi 试剂盒	Qiagen	12963
聚乙二醇 (PEG)-8000	Sigma	89510
氯化钾 (KCl)	Sigma	P9333
氢氧化钾颗粒	Sigma/Roche	1050121000
RNase 抑制剂，小鼠来源	NEB	M0314
RTS 氨基酸混合物	Biotechrabbit	BR1401801
氯化钠 (NaCl)	Sigma	S7653
亚精胺	Sigma	S0266
T7 RNA 聚合酶	NEB	M0251
Tris 溶液 (pH 8.0) - 1 M	Invitrogen	AM9856
来自 E. coli MRE 600 的 tRNA	Sigma/Roche	10109541001
尿苷 5'-三磷酸 - 100 mM	NEB	N0450L
Vibrio natriegens（野生型）冻干菌种	ATCC	14048