利用微流控微液滴培养系统实时监测细菌生长

摘要

来源：Jian, X. et. al., 利用微生物微滴培养系统（MMC）实现微生物自动化培养与适应性进化。J. Vis. Exp. (2022)

本视频展示了基于微流控液滴平台的细菌生长实时监测方法。通过生成含有细菌悬液的均一液滴，并引导其流经检测通道，该系统可连续进行光学测量以获取细胞密度，进而构建生长曲线。

方案

1. 准备工作

1. 将注射器针头（内径为0.41 mm，外径为0.71 mm）、快接接头A和试剂瓶（图1C）连接好，并在121 °C下高压灭菌15分钟。
   注意：灭菌时需将试剂瓶瓶盖略微松开。每次可多准备几个试剂瓶备用。
2. 使用0.22 µm聚偏二氟乙烯（PVDF）滤膜过滤微液滴培养系统（MMC）油。提前将微流控芯片（图1B）和MMC油放入超净台内，并在使用前用紫外灯照射灭菌30分钟。
   注意：有关快接接头A、试剂瓶、MMC油和微流控芯片的详细信息，请参见材料表。
3. 安装微流控芯片
   1. 打开操作室门（图1A），抬起光纤探头。
   2. 将电场孔与电场针对其，轻轻将芯片放置在芯片基座上，然后将两个定位柱插入定位孔中，并放下光纤探头（图1D）。
   3. 根据编号将芯片上的快接接头A连接至MMC对应的接口（C5-O5、C4-O4、C6-O6、C2-O2、CF-OF、C1-O1、C3-O3）。然后关闭操作室门。
4. 使用前，在油瓶中补充MMC油（约80 mL），并清空废液瓶中的废液。
   注意：废液通常为有机废液，请根据当地法律法规处理，具体要求可能因实验设置而异。

2. 在MMC中测量生长曲线

1. 初始菌液的制备
   1. 按照相关标准规程配制Luria-Bertani（LB）培养基，并在121°C下高压灭菌15分钟。
      注意：LB培养基成分：NaCl（10 g/L）、酵母提取物（5 g/L）和胰蛋白胨（10 g/L）。
   2. 从甘油保藏菌种中取出大肠杆菌（Escherichia coli (E. coli) ）MG1655菌株，在50 mL三角摇瓶中加入10 mL LB培养基，于37 °C、200 rpm条件下在摇床中培养5–8小时。
      注意：培养时间取决于具体菌株，最佳培养时期为对数生长期。
   3. 用新鲜培养基将培养后的E. coli MG1655菌液稀释至600纳米处的光密度（OD₆₀₀）为0.05–0.1，得到初始菌液（约配制10 mL）。
2. 点击初始化以启动MMC系统。初始化界面出现后，将培养温度设置为37 °C，光电信号值设为0.6（图2A）。初始化过程约需20分钟。
3. 在初始化过程中开启紫外灯（波长254 nm）。
4. 将初始菌液和MMC油注入试剂瓶中。
   1. 在洁净工作台上取出一个已灭菌的试剂瓶，并拧紧瓶盖。
   2. 使用10 mL无菌注射器，通过侧管针头向试剂瓶内注入3–5 mL MMC油。缓慢倾斜并旋转试剂瓶，使油充分浸润内壁。
   3. 注入约5 mL初始菌液，然后再次注入5–7 mL油，将试剂瓶充满。
   4. 拔出独立的快速接头A，将试剂瓶的快速接头A插入其对应的快速接头B，完成样品注入操作（图3A）。
5. 等待初始化结束，然后关闭紫外灯（波长254 nm）。
6. 打开操作室门，将试剂瓶放入金属浴中。
7. 拔出芯片的C2接头和试剂瓶的快速接头A，将试剂瓶的侧管接头连接至C2接头，顶部管接头连接至O2接头，然后关闭操作室门。
8. 点击生长曲线，选择生长曲线测定功能（图2A）。在参数设置界面中，输入数量为15，开启OD检测开关，并将波长设置为600 nm。点击开始以启动液滴生成，过程约需10分钟。注意：此处数量指待生成液滴的数量，波长指待检测OD的波长。根据实验需求设置数量（最大200）和波长（350–800 nm）。
9. 当主界面弹出提示“请将试剂瓶从C2与O2之间移除，完成后请点击确定按钮”时，打开操作室门，取出试剂瓶，并连接C2与O2接头。
10. 关闭操作室门，点击弹出窗口中的确定按钮，系统将自动培养液滴并检测OD值。
    注意：MMC系统在液滴通过光纤探头时检测OD值，因此检测周期取决于生成的液滴数量。
11. 当生长曲线进入稳定期后，点击数据导出按钮导出OD数据。选择数据保存路径，以.csv格式导出培养期间记录的OD值，该文件可用相应软件（如Microsoft Excel）打开。随后使用绘图软件（如EXCEL和Origin 9.0）绘制生长曲线。
    注意：在培养过程中，可随时点击数据导出按钮，导出当前所有液滴的OD数据。

结果

图1：MMC的结构及关键组件。（A）MMC的外部结构与操作腔室。（B）MMC的微流控芯片。该芯片包含七个通道（C1-C6和CF）。（C）试剂瓶。试剂瓶具有一个顶部管口和一个侧管口。在将样品注入试剂瓶之前，先将注射器针头连接至快速接头A，再将快速接头A连接至侧管口。（D）微流控芯片的安装。将微流控芯片安装在基座上，随后将七个通道（C1-C6和CF）分别连接至MM...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.22 μm PVDF 滤膜	Merck Millipore Ltd.	SLGPR33RB	对 MMC 油进行灭菌
4 °C 冰箱	Haier	BCD-289BSW	用于试剂储存
琼脂	Becton, Dickinson and Company	214010	用于固体培养基平板的制备
洁净工作台	北京东联哈瑞仪器制造有限公司	DL-CJ-INDII	用于无菌操作和紫外灭菌
计算机	Lenovo	E450	软件安装与 MMC 控制
恒温培养箱	上海齐欣科学仪器有限公司	LRH 250	用于固体培养基上的微生物培养
电子天平	OHAUS	AR 3130	用于试剂称量
EP 管	Thermo Fisher	1.5 mL	用于液滴收集
冻存管	Thermo Fisher	2.0 mL	用于菌种保藏
甘油	GENERAL-REAGENT	G66258A	用于菌种保藏
高压蒸汽灭菌锅	SANYO Electric	MLS3020	用于高压蒸汽灭菌
微生物微液滴培养系统（MMC）	洛阳泰茂树生物科技有限公司	MMC-I	用于生长曲线测定和适应性进化实验。详情请参见 http://www.tmaxtree.com/en/index.php?v=news&id=110
微流控芯片	洛阳泰茂树生物科技有限公司	MMC-ALE-OD	用于多种液滴操作。详情请参见 http://www.tmaxtree.com/en/
MMC 油	洛阳泰茂树生物科技有限公司	MMC-M/S-OD	液滴微流控中的油相。详情请参见 http://www.tmaxtree.com/en/
NaCl	GENERAL-REAGENT	G81793J	LB 培养基的组分
培养皿	Corning Incorporated	90 mm	用于固体培养基的制备
移液器	eppendorf	2.5 μL, 10 μL, 100 μL, 1000 μL	用于液体操作
快速接头 A	洛阳泰茂树生物科技有限公司	—	用于各接口的连接。详情请参见 http://www.tmaxtree.com/en/
试剂瓶	洛阳泰茂树生物科技有限公司	MMC-PCB	用于菌液和试剂的取样与储存。详情请参见 http://www.tmaxtree.com/en/
摇瓶	Union-Biotech	50 mL	用于微生物培养
摇床培养箱	上海苏坤工业有限公司	SKY-210 2B	用于摇瓶中的微生物培养
注射器	江苏知育医疗器械有限公司	10 mL	吸取液体并注入试剂瓶中
注射器针头	OUBEL 硬件商店	22G	内径为 0.41 mm，外径为 0.71 mm。
胰蛋白胨	Oxoid Ltd.	LP0042	LB 培养基的组分
超低温冰箱	SANYO Ultra-low	MDF-U4086S	用于菌种保藏（-80 °C）
紫外-可见分光光度计	General Electric Company	Ultrospec 3100 pro	用于测定 OD 值
酵母提取物	Oxoid Ltd.	LP0021	LB 培养基的组分