丝状蓝细菌Phormidium lacuna中的自然转化与GFP表达

摘要

来源：Weber, N., 等，丝状蓝细菌Phormidium lacuna的自然转化、蛋白表达与低温保存。J. Vis. Exp. (2022)

本视频介绍了一种利用质粒DNA通过同源重组在丝状蓝细菌中进行自然转化的方法，以实现稳定的绿色荧光蛋白（GFP）表达和抗生素抗性。

方案

1. 自然转化与GFP表达

注意：转化基于在大肠杆菌（Escherichia coli，E. coli）中扩增的质粒载体；可使用 pGEM-T 或 pUC19 作为骨架载体。用于超折叠绿色荧光蛋白（sfGFP）表达的载体示例见代表性结果部分。

1. 所有步骤均需在无菌实验室条件（超净工作台、无菌玻璃器皿）下使用无菌材料进行。
2. 取两份50 mL f/2液体培养基，分别加入两个250 mL锥形瓶中，并分别接种1 mL来自继代培养的Phormidium lacuna（P. lacuna）丝状体。在25 °C、白光光照（50 µmol m^-2 s^-1）及振荡（水平旋转，50 rpm）条件下培养约5天。
3. 根据试剂盒说明书，使用中量质粒提取试剂盒制备约200 µg转化载体DNA。
4. 将100 mL P. lacuna细胞悬液（参见材料表）在10,000 rpm下均质化处理3分钟。测定750 nm处的OD值（目标值 = 0.35）。
5. 将细胞悬液在6,000 × g下离心15分钟，弃上清液，将沉淀重悬于800 µL剩余液体及额外添加的f/2⁺培养基中（总体积包含残留液体和丝状体）。
6. 准备八块含120 µg/mL卡那霉素的f/2⁺细菌琼脂平板（直径10 cm）。将10 µg DNA用移液器加至每块琼脂平板中央，立即在DNA上方加入100 µL细胞悬液。
7. 将琼脂平板打开盖子置于超净工作台上，使多余液体蒸发。盖上盖子后，在25 °C白光条件下培养2天。
8. 用接种环将每块琼脂平板上的丝状体转移至若干新鲜的含120 µg/mL卡那霉素的f/2⁺细菌琼脂平板上。在25 °C白光条件下培养，并定期在显微镜下观察培养情况。
9. 在7–28天后于显微镜下识别存活且已转化的丝状体。寻找健康、呈绿色的丝状体（图1），其形态应与其他丝状体不同。若能识别出此类绿色丝状体，则继续下一步操作；否则将平板继续培养7天。
10. 用镊子将已识别的存活丝状体转移至含250 µg/mL卡那霉素的50 mL液体f/2⁺培养基中。在25 °C白光条件下，于摇床（水平旋转，50 rpm）上培养，观察生长情况，持续最长四周。
11. 将丝状体重新转移至含250 µg/mL卡那霉素的琼脂培养基上，待其生长后，数天后将单根丝状体转移至含更高浓度卡那霉素（例如500 µg/mL）的新鲜琼脂平板上。保留原始平板。
12. 确保丝状体在液体培养或琼脂培养基中于高浓度卡那霉素条件下传代培养。可再次提高卡那霉素浓度以加速基因分离。注意：转化后的P. lacuna可在高达10,000 µg/mL卡那霉素中生长，其他物种可能无法耐受如此高浓度。
13. 对于GFP表达检测：使用荧光显微镜观察单根丝状体，物镜放大倍数设为40x或63x。采集明场透射光图像和荧光图像。GFP检测参数如下：激发光波长470 nm带通滤光片，发射光波长525 nm带通滤光片，分光镜波长495 nm，初始曝光时间为500 ms。
14. 调整曝光时间以获得清晰的荧光信号，避免信号饱和。尽量对所有样品使用相同的成像设置。
15. 由于野生型丝状体也会产生自发荧光，需使用与上述相同设置采集背景荧光图像。​注意：表达GFP的菌株必须具有更高的荧光信号；否则视为未表达GFP。
16. 根据曝光时间和荧光图像的像素强度，计算并比较不同丝状体中的GFP含量。

结果

图1. Phormidium lacuna 转化后5周的丝状体。 使用了sfGFP表达载体pMH1；筛选在含120 µg/mL卡那霉素的f/2 培养基上进行。绿色丝状体为存活且具有抗性；其他丝状体已死亡。...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
细菌琼脂	OttoNorwald	214010
荧光显微镜 ApoTome	Zeiss
荧光显微镜 Axio Imager 2	Zeiss
卡那霉素	Sigma-Aldrich	25389-94-0
显微镜 DM750	Zeiss
质粒中提试剂盒 NucleoBond Xtra Midi kit	Macherey-NAGEL GmbH & Co. KG	REF740410.50
光源，荧光灯管 L18W/954 日光	OSRAM		蓝细菌培养
光源，LED 面板 XL 6500K 140 W	Bloom Star	N/A	蓝细菌培养
聚苯乙烯培养皿，100 mm × 20 mm	Merck	P5606-400EA
聚苯乙烯培养皿，60 mm × 15 mm	Merck	P5481-500EA
移液器 Pipetman 100–1,000 µL	Gilson	SKU: FA10006M
移液器 Pipetman 10–100 µL	Gilson	SKU: FA10004M
塑料移液管，10 mL，无菌	Greiner	607107
摇床 Unimax 2010	Heidolph Instruments		用于培养
塑料离心管，无菌，50 mL	Greiner	227261
超声破碎仪 Silent Crusher M	Heidolph Instruments		匀浆器
F/2+ 液体培养基	f/2-培养基，NaNO₃ 和 NaH₂PO₄ 浓度提高至10倍（0.88 mM NaNO₃，36 µM NaH₂PO₄）
F/2+-琼脂	3 % (w/v) 细菌琼脂，人工海水，0.1 % (v/v) 微量元素溶液，0.05 % (v/v) 维生素溶液，8.8 mM NaNO₃，0.36 mM NaH₂PO₄