通过同源重组在蓝细菌中产生抗生素标记突变体

摘要

来源： Lea-Smith, D. J., et al. 模式蓝细菌物种中标记型与无标记突变体的构建. J. Vis. Exp. (2016)

该视频演示了一种在蓝细菌中构建抗生素标记突变体的方法。本方案首先培养蓝细菌，随后进行离心和洗涤步骤，以保留其表面的菌毛。接着引入一个携带抗生素抗性基因的质粒，该基因两侧由同源序列包围。在培养过程中，质粒通过菌毛进入细胞，并通过同源重组替换目标基因。利用抗生素筛选和连续划线培养，分离并纯化获得突变菌株。

方案

1. Preparation of Culture Media
   1. 参照 Castenholz (1988) 的方法配制蓝藻培养基 11 (BG11 培养基)。
      1. Prepare stock solutions of 100x BG11, trace elements, and iron stock (Table 1).
      2. Prepare separate solutions of phosphate stock, Sodium carbonate (Na₂CO₃) stock, N-[Tris(hydroxymethyl)methyl]-2-aminoethanesulfonic acid (TES) buffer, and Sodium bicarbonate (NaHCO₃) (Table 1).
      3. 将磷酸盐和 Na₂CO₃ stocks. Filter-sterilize TES buffer and NaHCO₃ 使用 0.2 µm filters.
      4. 制备 BG11 培养基：将 976 ml 水、10 ml 100× BG11 母液、1 ml 微量元素母液和 1 ml 铁盐母液混合，并对溶液进行高压灭菌。待溶液冷却至室温后，加入 1 ml 磷酸盐母液和 1 ml Na₂CO₃ stock, and 10 ml of NaHCO₃.
      5. 对于 BG11 固体培养基，向一个烧瓶中加入 15 g 琼脂和 700 ml 水。向第二个烧瓶中加入 3 g 硫代硫酸钠 (Na₂S₂O₃226 毫升水、10 毫升 100x BG11、1 毫升微量元素和 1 毫升铁储备液。对两种溶液进行高压灭菌。待溶液冷却至室温后，将其混合并加入 1 毫升磷酸盐储备液、1 毫升 Na₂CO₃ stock, 10 ml of TES buffer, and 10 ml of NaHCO₃.
         NOTE: 为避免某些盐类沉淀，需分别配制各溶液。
2. 为进行蔗糖筛选，请配制50%（w/v）的蔗糖溶液。使用0.2微米滤膜对溶液进行过滤除菌。 µ用滤膜过滤并加入BG11培养基（100毫升50%蔗糖溶液加入900毫升BG11培养基）以制备含5%蔗糖的BG11平板。
   NOTE: 请勿添加 NaHCO₃₃ 至 BG11/5% 蔗糖琼脂平板。加入 Na₂CO₃ as normal.
3. For culturing of Synechococcus, add 10 ml of 1 M 4-(2-hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid, N-(2-hydroxyethyl)piperazine-N′-(2-ethanesulfonic acid) (HEPES), and 1 ml of vitamin B12 (Table 1) 至 1 L BG11 培养基中。
   NOTE: 使用市售 BG11 培养基培养的菌株，其转化效率显著低于本文所述的 BG11 培养基配方，因此不建议采用。

表1： 本研究中使用的溶液。

Stock solution recipes
Chemical	Amount (g)
100x BG11 (per L)
NaNO₃	149.6
MgSO₄·7H₂O	7.49
CaCl₂·2H₂O	3.6
Citric acid	0.6
Add 1.12 ml 0.25 M Na₂EDTA, pH 8.0
0.25 M Na₂EDTA, pH 8.0 (per 100 ml)
Na₂EDTA	9.3
Trace elements (per 100 ml)
H₃BO₃	0.286
MnCl₂·4H₂O	0.181
ZnSO₄·7H₂O	0.022
Na₂MoO₄·2H₂O	0.039
CuSO₄·5H₂O	0.008
Co(NO₃)₂·6H₂O	0.005
Iron stock (per 100 ml)
Ferric ammonium citrate	1.11
Phosphate stock (per 100 ml)
K₂HPO₄	3.05
Na2CO3 stock (per 100 ml)
Na₂CO₃	2
TES buffer, pH 8.2 (per 100 ml)
TES	22.9
NaHCO3 stock (per 100 ml)
NaHCO₃	8.4
HEPES, pH 8.2 (per 500 ml)
HEPES	119.15
Vitamin B₁₂ (Per 50 ml)
Cyanocobalamin	0.02
Luria Bertani media (Per 500 ml)
Luria Bertani broth	12.5
1 M MgCl₂ (Per 100 ml)
MgCl₂·6H₂O	20.33
Solution A (Per 200 ml)
MnCl₂·4H₂O	0.395
CaCl₂·2H₂O	1.47
2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid hydrate, 4-Morpholineethanesulfonic acid (MES)	0.4265
Solution A + glycerol
10 ml solution A
1.5 ml glycerol

2. 蓝细菌菌株的培养

1. 将菌株置于最大容量为50 ml的100 ml锥形瓶中培养，以每分钟120转（rpm）的转速振荡。用Parafilm密封BG11平板，并在平板侧面戳三个小孔以允许气体交换。将所有菌株置于30°C条件下培养。 °在光生物反应器中，于荧光灯管下，光照强度为20-40 μmol photons m⁻² s⁻¹的条件下培养。 µmol photons m-2 sec-1.
2. 请使用最佳无菌操作技术。所有蓝藻菌株的操作均须在层流超净工作台内进行。
   NOTE: 当菌株在含有蔗糖的培养基中培养时，这一点尤为重要，因为此类培养基极易受到污染。

3. 质粒构建体的构建

1. 使用引物设计软件（如 Primer3，网址：http://frodo.wi.mit.edu/primer3/）设计包含所需限制性内切酶位点的引物组，以扩增目标基因上游和下游各约 1 kb 的两个区域。’ and 3’ 目标基因。通过 Cyanobase (http://genome.kazusa.or.jp/cyanobase) 查阅该蓝藻物种的基因组序列。参见 Table 2 此处所用全部引物的序列。设计引物时，需考虑以下因素：
   1. 确保扩增区域包含待突变基因的 5' 和 3' 区域。 e.g,. Figure 1.
   2. 切勿诱变基因间区域，以避免反义RNA与非编码RNA发生非预期突变。
   3. 在选择侧翼区域时，请勿包含相邻基因的完整开放阅读框，因为这些基因的表达可能会 Escherichia coli 可能干扰克隆过程。
2. 使用高保真 DNA 聚合酶，按照制造商说明书进行聚合酶链式反应（PCR）扩增产物。
   NOTE: 根据我们的经验，该酶产生的错误极少。
   1. Set up 50 µl PCR reactions containing high-fidelity buffer (HF buffer) and either 0, 1.5, or 3 µl of Dimethyl Sulfoxide (DMSO). Use 100 ng of genomic DNA per reaction. Use a program consisting of an initial denaturation step of 98 °C for 30 sec, 35 rounds of 98 °C for 10 sec, 67 °C for 30 sec, 72 °C for 30 sec, followed by a final extension step of 72 °C for 5 min. This typically gives consistent products.
3. 通过凝胶电泳验证PCR产物及经限制性内切酶消化的样品大小是否正确。使用含0.02%（体积比）溴化乙锭的1%（质量体积比）琼脂糖凝胶，在100 V电压下电泳45分钟。CAUTION: 溴化乙锭是一种潜在诱变剂，操作时需采取适当防护措施。
4. 使用 DNA 纯化试剂盒，按照制造商说明书纯化 PCR 产物。该试剂盒亦适用于纯化质粒片段，包括从琼脂糖凝胶中切下的片段。将纯化的 DNA 洗脱于 14 µL 洗脱缓冲液中。 µl of water.
5. 对于克隆步骤，将限制性内切酶反应混合物在 37°C 下孵育。 °C for >1 hr in a total volume of 30 µ根据制造商说明书操作。
6. 在连接步骤中，于室温下进行 DNA 片段连接。 >1 hr in a total volume of 20 µl, containing 5 µl of purified digested plasmid, 12 µl of purified digested insert, 2 µl of buffer, and 1 µl of ligase.
7. Prepare Escherichia coli DH5α 根据以下方法处理转化细胞。
   1. Grow an overnight E. coli culture in 10 ml Luria Bertani (LB) media.
   2. Inoculate 400 ml LB in a 1 L conical flask containing 6 ml 1 M MgCl₂ (Table 1) 取 1 ml 过夜培养物。
   3. 在37°C条件下培养菌株。 °在 220 rpm 转速下于 C 培养约 4 小时或直至 OD₆₀₀ₙₘ reaches 0.4-0.6.
   4. 将细胞置于冰上 1 小时。
   5. 以 2,800 × g 的转速离心 × 4℃下以 10,000 g 离心 10 分钟，使细胞沉淀。 °C.
   6. Remove supernatant and resuspend in 160 ml solution A (Table 1) 并在冰上孵育 20 分钟。
   7. 以 2,800 × g 离心 × 在 4°C 下以 5000 × g 离心 10 分钟，使细胞沉淀。 °C.
   8. Remove supernatant and resuspend in 4 ml Solution A + glycerol (Table 1).
   9. Prepare 50 µ分装为小份，于液氮中速冻，-80°C 保存。 °C.
   10. Mix 5 µ将 50 µL 连接混合物与 µ将感受态细胞置于冰上孵育1小时。
   11. 将细胞在 42°C 进行热激处理。 °90 秒，随后冰上孵育 2 分钟。
   12. Add 950 µl of LB media (Table 1) 并于 37°C 下孵育 °C for 1 hr.
   13. Aliquot 50 and 200 µ在含有适当抗生素（氨苄青霉素（100 µg/ml) and/or kanamycin (30 µg/ml).
       CAUTION: 卡那霉素与氨苄青霉素均具有毒性，操作时需采取适当的防护措施。
   14. 挑取单菌落，接种于含相应抗生素的 2 ml LB 培养基中，进行培养。
8. 使用微量质粒纯化试剂盒，按照制造商说明书纯化所有质粒。
9. 构建质粒，在本具体示例中用于敲除 cpcC1C2 基因，具体步骤如下。
   1. 使用引物 cpcC1C2leftfor 和 cpcC1C2leftrev（参见步骤 3.2）扩增长度为 1,012 个碱基对 (bp) 的 5' 侧翼区域（左侧片段）。 Table 2）。取少量 PCR 反应产物，通过凝胶电泳（步骤 3.3）确认是否已扩增出预期大小的产物。用限制性内切酶消化该片段及 pUC19 质粒。 XbaI and BamHI (step 3.5).
   2. 纯化两份制备产物（步骤3.4），进行连接反应（步骤3.6），完成转化（步骤3.7），并设置四个含氨苄青霉素（100 µg/ml）的2毫升LB液体培养体系。 µg/ml）的培养基，用于通过微量制备法纯化质粒（步骤 3.8）。
   3. 通过酶切验证片段是否已插入 pUC19 载体。 XbaI/BamHI 酶切与凝胶电泳（步骤 3.3）。出现 2,660 bp 和 1,012 bp 的条带表明插入片段已正确导入质粒。
   4. 使用引物 cpcC1C2rightfor 和 cpcC1C2rightrev 扩增 1,016 bp 的 3' 侧翼区域（右侧片段）（参见步骤 3.2）。 Table 2）。取少量 PCR 反应产物，通过凝胶电泳（步骤 3.3）确认是否扩增出预期大小的产物。将此片段与 pUC19 质粒进行酶切。 SacI and EcoRI (step 3.5).
   5. 纯化两份制备产物（步骤3.4），进行连接反应（步骤3.6），完成转化（步骤3.7），并设置四份含氨苄青霉素（100 µg/mL）的2 mL LB液体培养物。 µg/ml）的 LB 培养基中，用于通过微量提取法纯化质粒（步骤 3.8）。
   6. 通过酶切验证片段是否插入 pUC19 SacI/Eco限制性内切酶 RI 消化（步骤 3.5）与凝胶电泳（步骤 3.3）。出现 2,660 bp 与 1,016 bp 的条带表明插入片段已正确导入质粒。NOTE: XbaI/Bam用于克隆5'区域的HI位点 SacI/Eco在可能的情况下，应使用克隆3'区域至pUC19的限制性内切酶识别位点。如条件允许，务必包含一个 Bam在5'区域的反向引物或3'区域的正向引物上引入HI位点，以确保后续克隆步骤更易于进行。
   7. 使用跨越插入位点的引物对两个插入片段进行测序，以确定序列是否正确。 e.g., M13 forward and M13 reverse (Table 2）。序列必须正确无误，以确保侧翼区域不会引入错误。
   8. 从 pUC19 质粒中切下左侧片段。 XbaI/BamHI 酶切。使用 HI 酶对 pUC19 + 右侧片段进行酶切。 XbaI/BamHI (step 3.5).
   9. 使用手术刀片从琼脂糖凝胶中切下并纯化 1,012 bp 的左片段和 3,676 bp 的 pUC19 + 右片段（步骤 3.3）。
   10. 纯化两份制备产物（步骤3.4），进行连接反应（步骤3.6），完成转化（步骤3.7），并设置四份含氨苄青霉素（100 µg/ml）的2 ml LB液体培养基。 µg/ml）的培养基，用于通过微量制备法纯化质粒（步骤 3.8）。
   11. 通过酶切验证片段是否插入 pUC19 + 右侧片段 XbaI/BamHI 酶切消化（步骤 3.5）与凝胶电泳（步骤 3.3）。出现 3,676 bp 与 1,012 bp 的条带表明插入片段已正确插入质粒（将此质粒称为质粒 B）。
   12. 切除新霉素磷酸转移酶/果聚糖蔗糖酶基因（npt1/sacB) 来自 pUM24cm19 的卡盒 BamHI 酶切。用 HI 酶消化质粒 B。 BamHI (step 3.5).
       NOTE: The npt1/sacB 由于 pUM24cm 质粒编码了赋予氯霉素抗性的蛋白，因此无需从琼脂糖凝胶中纯化该盒。所以，若在 LB/氨苄青霉素/卡那霉素琼脂平板上培养菌落，唯一可能导致抗性菌落出现的组合便是该盒的整合。 npt1/sacB 将盒式片段插入质粒 B。
   13. 纯化两份制备产物（步骤3.4），进行连接反应（步骤3.6），完成转化（步骤3.7），并设置四份含氨苄青霉素（100 µg/mL）的2 mL LB液体培养物。 µg/ml) and kanamycin (30 µ从不同菌落中挑取单克隆，用于通过微量制备法纯化质粒（步骤 3.8）。
   14. 检查抗生素抗性基因的插入情况 npt1/sacB 通过同源重组将表达盒插入质粒B BamHI 酶切（步骤 3.5）与凝胶电泳（步骤 3.3）。4,688 bp 与 3,894 bp 条带表明插入片段已正确插入质粒（将此质粒称为质粒 A）。

表2：本研究中使用的引物。 限制性内切酶位点已用下划线标出。

Primer	Sequence
cpcC1C2leftfor	GTACTCTAGAGCGGCTAAATGCTACGAC
cpcC1C2leftrev	GATCGGATCCGCGGTAATTGTTCCCTTTGA
cpcC1C2rightfor	GATCGAGCTCTGCACTGGTCAGTCGTTC
cpcC1C2rightrev	GACTGAATTCATCGTTGCTTGAACGGTCTC
M13 forward	TGTAAAACGACGGCCAGT
M13 reverse	CAGGAAACAGCTATGAC
cpcC1C2for	GTTTTCATTGGCATCGGTCT
cpcC1C2rev	ATGTCCCAGGAACGACTGAC
A1173for	AGCAAACCGTTTTTGTGACC
A1173rev	TGCAAGGTGGCGAACTGTAT

4. 获得有标记的Synechocystis和Synechococcus突变株

1. 通过将一环细胞接种至30–50 ml BG11培养基中，建立新鲜培养物。将培养物在750纳米波长下培养2–3天，至光密度（OD）达到适宜值。₇₅₀ₙₘ = 0.2 至 0.6。
   注意： 通常，单个菌落过小而无法用于接种，且单个细胞即使暴露于低强度光照下也会导致光抑制，并筛选出耐光突变体。
2. 离心1-2 ml培养物于2,300 × g × 5 分钟，弃去上清液。切勿对任何蓝细菌培养物进行离心处理。 >2,300 × g，以免损伤细胞。用 BG11 培养基洗涤菌体沉淀一次。
   注意： 切勿通过涡旋振荡重悬细胞，因为这可能导致鞭毛丢失，而鞭毛对DNA摄取至关重要。应通过轻柔吹打重悬细胞。
3. 加入BG11培养基至终体积 100 µl将细胞转移至14 ml圆底管中。
4. 添加 1 µg 将质粒A加入细胞中，轻轻敲击混匀。添加 <10 µl 质粒的
   注意： 最好将质粒浓度调整为 >100 ng/µl但低于此浓度也可实现有效的转化。
5. 将试管水平放置于培养箱中。培养4-6小时。
   注意： 可每隔1-2小时轻轻敲击混匀细胞，但此步骤并非必需。样品可置于摇床培养箱中培养，但此操作对效率提升无明显作用。
6. 将细胞培养物与质粒DNA混合液的等份样品涂布于不含抗生素的BG11琼脂平板上。通常， 20 µl 和 80 µl 将等量样品分别涂布于不同的平板上。
7. 约24小时后，加入2.5–3 ml含卡那霉素的0.6%琼脂水溶液（每20 ml含0.12 g琼脂） 100 µl 100 mg/ml 卡那霉素的溶液加入琼脂平板中。将此溶液冷却至约42 °C 将其加入琼脂平板边缘，倾斜平板使溶液在表面形成均匀的“顶层琼脂”层。
8. 将琼脂平板继续孵育一段时间。大约 7 天后应可见菌落。
   注意： 琼脂平板可在培养箱中叠放，最多三层。通常每次转化可获得数百个菌落。
9. 在 BG11 + 卡那霉素平板上划线分离单菌落30 µg/ml) 琼脂平板。将琼脂平板分为6个区域，用钝头牙签在每个区域内划线接种菌落。此步骤无需获得单菌落，只需确保转化子能够生长即可。

结果

图1：用于构建标记和无标记敲除突变体的质粒，例如 cpcC1 和 cpcC2 在...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
NaNO₃	Sigma	S5506
MgSO₄·7H₂O	Sigma	230391
CaCl₂	Sigma	C1016
柠檬酸	Sigma	C0759
Na₂EDTA	Fisher	EDT002
H₃BO₃	Sigma	339067
MnCl₂·4H₂O	Sigma	M3634
ZnSO₄·7H₂O	Sigma	Z4750
Na₂MoO₄·2H₂O	Sigma	331058
CuSO₄·5H₂O	Sigma	209198
Co(NO₃)₂·6H₂O	Sigma	239267
柠檬酸铁铵	Sigma	F5879
K₂HPO₄	Sigma	P3786
Na₂CO₃	Fisher	SODC001
TES	Sigma	T1375
NaHCO₃	Fisher	SODH001
HEPES	Sigma	H3375
氰钴胺	Sigma	47869
Na₂S₂O₃	Sigma	72049
细菌琼脂	BD	214010
蔗糖	Fisher	SUC001
90 mm 三通气式培养皿	Greiner	633185
0.2 µm 滤膜	Sartorius	16534
100 ml 锥形瓶	Pyrex	CON004
Parafilm M 100 mm × 38 m	Bemis	FIL003
Phusion 高保真 DNA 聚合酶	Phusion	F-530
琼脂糖	Melford	MB1200
DNA 纯化试剂盒	MoBio	12100-300
限制性内切核酸酶	NEB
T4 连接酶	Thermo Scientific	EL0011
LB 液体培养基	Invitrogen	12795-027
MES	Sigma	M8250
硫酸卡那霉素	Sigma	60615
氨苄青霉素	Sigma	A9518
GeneJET 质粒小提试剂盒	Thermo Scientific	K0503
14 ml 圆底管	BD falcon	352059
甘油	Sigma	G5516
DMSO	Sigma	D8418