通过同源重组在蓝细菌中产生抗生素标记突变体

摘要

来源： Lea-Smith, D. J., et al. 模式蓝细菌物种中标记型与无标记突变体的构建. J. Vis. Exp. (2016)

该视频演示了一种在蓝细菌中构建抗生素标记突变体的方法。本方案首先培养蓝细菌，随后进行离心和洗涤步骤，以保留其表面的菌毛。接着引入一个携带抗生素抗性基因的质粒，该基因两侧由同源序列包围。在培养过程中，质粒通过菌毛进入细胞，并通过同源重组替换目标基因。利用抗生素筛选和连续划线培养，分离并纯化获得突变菌株。

方案

1. Preparation of Culture Media
   1. 参照 Castenholz (1988) 的方法配制蓝藻培养基 11 (BG11 培养基)。
      1. Prepare stock solutions of 100x BG11, trace elements, and iron stock (Table 1).
      2. Prepare separate solutions of phosphate stock, Sodium carbonate (Na₂CO₃) stock, N-[Tris(hydroxymethyl)methyl]-2-aminoethanesulfonic acid (TES) buffer, and Sodium bicarbonate (NaHCO₃) (Table 1).
      3. 将磷酸盐和 Na₂CO₃ stocks. Filter-sterilize TES buffer and NaHCO₃ 使用 0.2 µm filters.
      4. 制备 BG11 培养基：将 976 ml 水、10 ml 100× BG11 母液、1 ml 微量元素母液和 1 ml 铁盐母液混合，并对溶液进行高压灭菌....

结果

图1：用于构建标记和无标记敲除突变体的质粒，例如 cpcC1 和 cpcC2 在.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
NaNO₃	Sigma	S5506
MgSO₄·7H₂O	Sigma	230391
CaCl₂	Sigma	C1016
柠檬酸	Sigma	C0759
Na₂EDTA	Fisher	EDT002
H₃BO₃	Sigma	339067
MnCl₂·4H₂O	Sigma	M3634
ZnSO₄·7H₂O	Sigma	Z4750
Na₂MoO₄·2H₂O	Sigma	331058
CuSO₄·5H₂O	Sigma	209198
Co(NO₃)₂·6H₂O	Sigma	239267
柠檬酸铁铵	Sigma	F5879
K₂HPO₄	Sigma	P3786
Na₂CO₃	Fisher	SODC001
TES	Sigma	T1375
NaHCO₃	Fisher	SODH001
HEPES	Sigma	H3375
氰钴胺	Sigma	47869
Na₂S₂O₃	Sigma	72049
细菌琼脂	BD	214010
蔗糖	Fisher	SUC001
90 mm 三通气式培养皿	Greiner	633185
0.2 µm 滤膜	Sartorius	16534
100 ml 锥形瓶	Pyrex	CON004
Parafilm M 100 mm × 38 m	Bemis	FIL003
Phusion 高保真 DNA 聚合酶	Phusion	F-530
琼脂糖	Melford	MB1200
DNA 纯化试剂盒	MoBio	12100-300
限制性内切核酸酶	NEB
T4 连接酶	Thermo Scientific	EL0011
LB 液体培养基	Invitrogen	12795-027
MES	Sigma	M8250
硫酸卡那霉素	Sigma	60615
氨苄青霉素	Sigma	A9518
GeneJET 质粒小提试剂盒	Thermo Scientific	K0503
14 ml 圆底管	BD falcon	352059
甘油	Sigma	G5516
DMSO	Sigma	D8418