高通量荧光检测法研究微生物-线虫相互作用

摘要

来源： Ali, I., 等 高通量筛选影响微生物分离物 秀丽隐杆线虫 健康。 视频实验杂志 (2022)

本视频展示了一种高通量荧光检测方法，用于评估肠道细菌对秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）应激耐受性的影响。通过检测肠道颗粒破裂释放的蓝色荧光，该检测可揭示暴露于待测细菌的线虫更早出现的死亡信号。

方案

无标记 秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans） 生存评分（LFASS）、热激与氧化应激实验设置（第13-14天）

1. 评估线虫的发育阶段。当>90%的线虫达到L4阶段时，将线虫收集至15 mL锥形管中，最多加入10 mL无菌M9溶液。
2. 通过在4 °C下以142×g离心2分钟，弃去上清液，并在每次洗涤之间加入10 mL新鲜无菌M9溶液，彻底清洗线虫（至少4次），以去除Escherichia coli OP50细菌。将线虫沉淀重悬于10 mL M9溶液中。
3. 将50 µL线虫溶液转移至含有950 µL M9的低吸附表面管中。轻轻混匀管内液体以避免线虫沉降，然后迅速使用润湿的低吸附枪头将3–4个独立的10 µL液滴滴加到玻璃载片或线虫生长培养基（NGM）平板上。在体视显微镜下以16倍放大倍数计数线虫数量。取3–4个液滴的计数平均值，确定线虫溶液中每微升的线虫数量。
4. 调整10 mL管中线虫浓度，使其达到约8 µL中含有120条线虫。如果步骤1.2中制备的溶液浓度过低，可将线虫离心后去除适量M9溶液，直至达到每8 µL含120条线虫。
5. 使用多通道移液器或重复移液器，将8 µL线虫溶液（约120条线虫）分别加入先前制备好的八块96孔NGM-琼脂糖平板的各个孔中。确保使用低吸附枪头以减少线虫损失。必要时可剪去枪头末端，以便大体型成年线虫通过，从而降低对成年线虫的机械损伤。
   注意：该实验每孔至少需要30条健康存活的线虫才能可靠运行，但每孔约100条线虫时效果最佳。
6. 将接种了线虫和细菌的96孔NGM-琼脂糖平板在25 °C下孵育36小时。
7. 在孵育12–24小时期间检查平板，确保线虫始终处于饱食状态。若需补充喂养，应将储存在15 °C的96孔细菌阵列板中的细菌重新混悬，并向可能在36小时孵育结束前发生饥饿风险的96孔NGM-琼脂糖平板中加入最多10 µL相应的细菌溶液（饥饿线虫会产生显著不同的结果，因此此步骤极为重要）。
   注意：以下步骤需在第15天进行。在开始实验前，可能需要优化读板高度。最佳读数位置为孔底部上方20–50 µm处，具体取决于酶标仪型号。部分仪器提供Z轴扫描功能，而另一些则允许手动输入高度。应设定在蓝色荧光（365 nm/430 nm）信号最强的位置作为最优高度。某些酶标仪的工作高度固定，专为贴壁细胞实验优化，可能不适用于LFASS实验。
8. 孵育36小时后，向96孔板的每孔中加入30 µL M9溶液。
   注意：对于热应激实验，酶标仪需提前开启并达到实验所需温度。本方案采用42 °C以最大化杀伤速度，但该方法同样适用于30 °C以上的其他温度。
9. 使用低吸附枪头按照预设布局将线虫（约20 µL）转移至384孔板中（可考虑剪去枪头末端，以便大体型线虫通过，减少对成年线虫的机械损伤）。
   注意：本研究中，所描述的两种实验（热应激和氧化应激）使用不同的酶标仪设置，因此用于这两种实验的样品不得置于同一块384孔板中。
10. 确保酶标仪已正确设置（表1）。
11. 用更多M9溶液补足384孔板，使每孔最终体积达到60 µL。对于热应激实验，加入40 µL M9；对于叔丁基过氧化氢（t-BHP）诱导的氧化应激实验，加入34 µL M9和6 µL t-BHP。
    1. 在加入t-BHP后2分钟内启动实验（理想情况下，所有线虫应同时暴露于t-BHP，实验时间分辨率为2分钟）。若无法实现，应使用计时器记录加入t-BHP过程中移液所耗时间，以便后续校正死亡中位时间。
12. 用透明盖板封闭平板，并用封口胶带密封384孔板边缘（胶带覆盖板和盖），确保胶带不覆盖盖板上方或插入板下方。使用手术刀在盖板与板之间间隔划开胶带，以允许气体交换，同时在实验过程中尽量减少蒸发。
13. 将平板插入酶标仪并开始运行。设定激发波长为365 nm，每2分钟检测一次435 nm处的发射光，持续6–12小时（表1）。
    注意：通常，42 °C热应激实验6小时已足够，7% t-BHP氧化应激实验则需8小时。

表1：氧化应激和热应激检测设置。本研究中使用的荧光酶标仪进行氧化应激（A）和热应激（B）检测时所采用的设置示例。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
384孔黑色透明平底板	Corning	3712 或 3762	快速应激检测中无需无菌
96孔透明板（Biolite）	Thermo	130188
琼脂糖	Fisher Scientific	BP1356
LoBind吸头	VWR	732-1488	Lo-bind可减少转移过程中的线虫损失
LoBind管	Eppendorf	22431081
酶标仪－infinite M nano+	Tecan		单色器设置可实现荧光调节，但使用滤光片的系统也可满足要求
酶标仪－Spark	Tecan
配备透射照明底座的体视显微镜系统	Leica	MZ6 或 M80	需要具备0.6–0.8倍至40–60倍的放大倍数，同时需要高质量的透射照明底座，配备可变形、可倾斜或可滑动的反射镜以调节对比度
t-BHP（叔丁基过氧化氢）	Sigma-Aldrich	458139
透明粘性封板膜（Nunc）	Fisher Scientific	101706871	必须为透明材质，并能耐受实验过程中涉及的温度