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1. 无标签秀丽隐杆线虫（C. elegans）生存评分（LFASS）、热休克及氧化检测设置（第13-14天）
- 评估蚯蚓的发育阶段。当>90%的线虫达到L4后，将线虫收集到最多10毫升无菌M9溶液中，装入15毫升锥形管中。
- 对蚯蚓进行充分清洗（至少4次），方法是用142x液体在4°C下旋转2分钟，去除上清液，并在每次清洗间加入10毫升新鲜无菌M9，以清除大肠杆菌OP50细菌。将蚯蚓沉淀剂重新浸泡在10毫升M9中。
- 将50微升的蚯蚓溶液转移到含有950微升M9的低表面结合管中。在轻柔混合管内内容物以避免蚯蚓沉积后，迅速使用湿润的低结合移液器尖端，将3-4滴10微升滴剂转移到玻片或线虫培养基（NGM）板上。在立体显微镜下以16倍放大率计数蠕虫数量。将3-4滴液的计数平均，确定每微升蚯蚓溶液中的蚯蚓数量。
- 将10毫升管内的线虫浓度调整至8微升中约120条线虫。如果解答是在步骤1.2中准备的。浓度不足时，将蚯蚓减速并相应去除M9，达到每8微升120蚯蚓。
- 使用多通道移液器或重复移液器，将8微升蚯蚓溶液（~120蚯蚓）转移到八个96孔NGM琼脂糖板的每个孔中。务必使用低滞留剂以减少蚯蚓损失。有时还需要剪掉末端，以便大型成虫能进入，以减少对成虫的机械压力。
注意： 该检测至少需要30条活体健康线虫才能可靠工作，但每孔约100条线虫效果最佳。 - 在25°C下孵育线虫和细菌种子的96孔NGM琼脂糖板，孵育36小时。
- 在12到24小时间检查盘子，确保蚯蚓始终充足。如果需要重新喂养，将细菌重新悬浮在96孔的细菌阵列板中，储存温度为15°C，并在36小时潜伏期结束前有饥饿风险的96孔NGM琼脂糖板上添加最多10微升的细菌溶液（饥饿的蠕虫结果差异极大， 所以这非常重要）。
注意： 第15天需要执行以下步骤。在开始检测之前，可能需要优化读数高度。最佳读数将在井底上方20-50微米处实现。这取决于版面读写器的型号。有些支持Z扫描，有些则允许手动输入高度。将最佳高度设在检测到最高蓝色荧光（365 nm/430 nm）的水平。部分板读器可能工作于固定高度，优化于粘附细胞检测，可能不适合LFASS测定。 - 36小时后，向96孔板的每个孔注入30微升M9。
注意： 对于热应力检测，板读器需要达到执行检测所需的温度，可能需要提前开启。目前的协议使用42°C以最大化杀死速度，但该方法适用于30°C以上的其他温度。 - 根据固定布局，将约20微升的线虫转移到384孔板上，使用低滞留力的尖端（考虑切断尖端末端，以便大型线虫减少成虫的机械应力）。
注意： 本研究中，针对此处描述的两种检测（热应力和氧化应力）采用了两种不同的板读器设置，因此，用于这两种检测的样品不得在同一块384孔板上进行板化。 - 确保板读器正确设置（见表1）。
- 在384孔板上补充更多M9，目标是每孔最终体积为60微升。热应力测定时，加入40微升M9;对于叔丁基过氧化物（t-BHP）诱导的氧化应激，则在6微升t-BHP中加入34微升M9。
- 检测应在加入t-BHP后2分钟内开始（理想情况下，所有线虫必须同时暴露于t-BHP，测定时间分辨率为2分钟）。如果无法行，使用计时器估算在检测开始前移液t-BHP的时间，以便后续调整中位死亡时间。
- 用透明盖子盖住盘子。用遮蔽胶带封住384孔板的边缘（用胶带封住板和盖子），确保胶带不会覆盖盖子或盖子下方。用手术刀在盖子和板子之间间隔割开胶带，以允许空气交换，同时减少检测过程中的蒸发。
- 将车牌插入读板器，开始运行。目标是在365纳米激发，并在435纳米发射时每2分钟探测一次，持续6-12小时（表1）。
注意： 通常，6小时足够进行42°C热应力测定，8小时用于7% t-BHP氧化应激测定。
表1：氧化和热应激测定设置。本研究中使用的荧光板读器上用于氧化（A）和热（B）应力测定的示例。