一种用于重组细菌蛋白纯化的亲和色谱技术

摘要

来源： Becker， B. 等人。一种简单的荧光报告测定法，用于识别酵母中蓖麻毒素A链（RTA）运输所需的细胞成分。 J. Vis. Exp. （2017年）。

本视频演示了利用镍基亲和色谱纯化多组氨酸标记的重组蛋白。报告概述了关键步骤，包括通过超声波分解细菌、裂解液的澄清和过滤，以及使用咪唑选择性结合和洗脱目标蛋白。

方案

1. 通过亲和色谱纯化His标记的RTA

1. 冰上超声处理，使用以下方法：脉冲15秒（20微米），暂停30秒。重复这一步五次。
2. 离心细胞在21,000 x g和4°C下溶解15分钟，并使用无菌注射器过滤系统（孔径0.2微米）进行过滤上清液。
   注意： 成功超声检测样品的细胞颗粒显示透明边界。
3. 使用配备5 mL Ni²⁺亲和柱的自动纯化系统，纯化无菌过滤大肠杆上清液中His标记的RTA分数。一般使用1毫升/分钟的洗脱速度，并冷却整个纯化系统，以防止毒素结合效率低下和毒素活性丧失。
   注意： 高效RTA净化的参数列于 表1。
   1. 简而言之，用20毫升结合缓冲液平衡亲和柱以去除储存缓冲液。用注射器将无菌过滤的上清液注入亲和柱上。
   2. 用25-35毫升结合缓冲液清洗柱子，去除柱中未结合的蛋白质。执行洗涤步骤，直到280纳米的紫外线吸收接近初始紫外线值。
   3. 将浸出结合的RTA分数置于20-35毫升洗脱缓冲液中（500 mM咪唑，500 mM NaCl，20 mM KH₂PO 4，pH=7.2），并将样品冰....

结果

图1：含有pET-RTA_（His）6或空载体对照的大肠杆菌细胞的代表性亲和层析和脱盐结果。（A）载体pET24-RTA_（His）6中表达RTA_（His）6的大肠杆菌裂解液样本典型纯化图。蓝色曲线表示由氨基酸Trp、Tyr和Cys的芳香环引起的280纳米紫外线吸收，作为蛋白质指示。在柱装载过程中，在流通（0-10 m.......

材料