一种用于纯化重组细菌蛋白的亲和层析技术

摘要

来源：Becker, B., et al．一种基于荧光报告基因的简易检测方法，用于鉴定酵母中蓖麻毒素A链（RTA）转运所需的细胞组分．J. Vis. Exp. （2017）．

本视频演示了利用镍基亲和层析纯化带有聚组氨酸标签的重组蛋白。内容包括关键步骤：通过超声处理裂解细菌、澄清并过滤裂解液，以及利用咪唑选择性结合和洗脱目标蛋白。

方案

1. 通过亲和层析纯化 His标签RTA

1. 按照以下程序在冰上进行细胞超声处理：脉冲15秒（20微米），暂停30秒。重复此步骤五次。
2. 将细胞裂解液在21,000 × g、4 °C条件下离心15分钟，并使用无菌注射器滤器系统（孔径0.2 µm）过滤上清液。
   注意： 超声处理成功的样品其细胞沉淀边缘呈透明状。
3. 使用配备5 mL镍离子（Ni²⁺）亲和层析柱的自动化纯化系统，从经无菌过滤的E. coli上清液中纯化带His标签的RTA组分。通常采用1 mL/min的洗脱速度，并对整个纯化系统进行冷却，以防止毒素结合效率降低及活性丧失。
   注意： 高效纯化RTA的相关参数见表1。
   1. 首先，用20 mL结合缓冲液平衡亲和层析柱，以去除保存液。使用注射器将经无菌过滤的上清液上样至亲和层析柱。
   2. 用25–35 mL结合缓冲液洗涤层析柱，以去除未结合的蛋白质。持续洗涤直至280 nm处的紫外吸光度接近初始紫外值。
   3. 用20–35 mL洗脱缓冲液（500 mM咪唑、500 mM NaCl、20 mM KH₂PO₄，pH = 7.2）洗脱结合的RTA组分，并将样品置于冰上保存（图1A和图1B）。
      注意： RTA组分的洗脱表现为紫外吸收值升高。请注意仅收集该洗脱峰，以避免非特异性结合蛋白的污染。

表1：基于层析柱的亲和纯化与脱盐所用参数。所有相关柱参数设置（例如，流速、洗脱缓冲液浓度、平衡和洗涤步骤持续时间）及测量参数（例如，电导率或紫外吸收）列表。

亲和层析参数
检测参数	UV (280 nm)、洗脱缓冲液浓度、电导率
设置	变量/单位	数值
流速	mL/min	1
最大柱压	MPa	0.35
波长	nm	280 nm
结合缓冲液	泵位置	A
洗脱缓冲液	泵位置	B
洗脱缓冲液起始浓度	%	0
系统体积补偿	mL	10
柱平衡	mL	20
通过超环/注射器进样	mL	细胞裂解物体积
洗涤步骤	mL	20–35
洗脱步骤	mL	20–35
洗脱过程中洗脱缓冲液浓度	%	100
用20%乙醇重新校准柱	mL	50
脱盐参数
检测参数	UV (280 nm)、电导率
设置	变量/单位	数值
流速	mL/min	4
最大柱压	MPa	0.35
波长	nm	280 nm
结合缓冲液	泵位置	A
洗脱缓冲液	泵位置	B
洗脱缓冲液起始浓度	%	0
系统体积补偿	mL	10
柱平衡	mL	20
通过超环/注射器进样	mL	细胞裂解物体积
脱盐缓冲液注入（0.8 M 山梨醇）	mL	100
用20%乙醇重新校准柱	mL	50

结果

图1：含有 pET-RTA_(His)6 或空载体对照的 E. coli 细胞的代表性亲和层析与脱盐结果。（A）表达来自 pET24-RTA_(His)6 载体的 RTA_(His)6...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
分光光度计 Ultrospec 2100 pro	Amersham
Soniprep 150	MSE		旧型号，有其他型号可选
Fluoroskan Ascent	Thermo Scientific	5210470	旧型号，已不再供应
ÄKTAPurifier	Thermo Scientific	28406266	产品已停产并被替代
HisTRAP HP 柱	GE Healthcare	17-5248-02
HiTRAP 脱盐柱	GE Healthcare	11-0003-29
Midisart 无菌滤器	Sartorius	16534K	孔径 0.2 µm
BCA 蛋白检测试剂盒	Pierce	23225
660 nm 检测试剂盒	Thermo Scientific	22660
96 孔板	Thermo Scientific	260860