纤维素生产细菌的细菌纳米纤维素薄膜制备

1. 细菌纳米纤维素（BNC）的制备

注意： 除非另有说明，所有步骤均在无菌条件下进行。

1. 准备培养基。
   1. 将25克酵母提取物、15克佩普通、125.0克甘露醇和500毫升高纯度水混合，制备500毫升液体培养基。将混合物在120°C高压灭菌20分钟，然后在4°C下保存。
   2. 通过加入15克琼脂、5.0克酵母提取物、3.0克佩普通、25.0克甘露醇和100毫升高纯水，制备100毫升半固态培养基。将混合物在120°C高压灭菌20分钟。高压灭菌后，将5毫升混合物沉入一个90毫米×16毫米的塑料培养皿中。让溶液凝胶至4°C，并在此温度下储存，等待进一步使用。
2. 根据制造商说明，加入1毫升液体培养基并上下移液，重新水化冻干瓶中保存的 木质葡萄糖醋酸菌 株（G. xylinus ）。
3. 用接种环为含有半固态培养基的培养皿注入细菌悬浮液的小滴。确保接种物覆盖整个培养皿，方法是将环从边缘之字形移动到培养皿中心。
4. 培养皿在26°C下无二氧化碳的孵化器中孵化72小时。孵化期结束后，可以看到小型白色群体。如果菌落未立即使用，需将培养皿密封在4°C，用防腐胶封盖并倒置放置。蜂群可以这样储存长达6个月。
5. 将2毫升液体培养基转移到24孔组织培养板的每个孔中。取两个菌落，用接种针从已接种的培养皿中取出，放入组织培养皿的第一个槽中。对剩余的23口井重复同样的作。
6. 将组织培养板在30°C下孵育7天。这将产生共24个直径16毫米、直径约2-3毫米的BNC薄膜，如 图1所示。注意： 在培养期间，切勿扰动细菌培养物，例如摇晃培养皿。在孵育期间， 木氏菌 挤出葡萄糖糖分子，形成空气-液体界面中的聚合物晶体网，在静态培养条件下呈现瓶子的形状和大小。这种聚合物基质称为细菌纳米纤维素（BNC），在孵育期结束时非常显眼。
7. 从培养基中采集BNC膜，并在50°C下用200毫升1%氢氧化钠溶液消毒1小时，以去除所有 木质菌的痕迹。可选地，使用磁棒和搅拌板以300转/分钟搅拌此溶液。丢弃NaOH溶液，加入200毫升新鲜制备的1%氢氧化钠溶液。重复同一过程，直到溶液中的BNC薄膜呈现半透明。
8. 用水冲洗BNC膜三次，并用高纯度的水在RT中保存。确保BNC膜完全浸没在水中，且任何时候都不允许干燥。
9. 将BNC膜材在121°C下高压灭菌20分钟。注：Märtson及其同事对大鼠进行的 体内 皮下研究显示，植入60周后BNC无降解迹象。事实上，BNC在自然界中可被微生物和真菌酶降解，而这些酶在哺乳动物中并不存在。另一方面，BNC的可生物降解性可能是由于机械、化学和生物过程在 体内削弱微纤维网络所致。

图1。细菌纳米纤维素的宏观方面。 经过11天的潜伏期，BNC膜片已获得，约为厚度3毫米。孵化期取决于预期用途的需求。