由产纤维素细菌制备细菌纳米纤维素膜

摘要

来源： Arias, S. L., et al．利用氧化铁纳米颗粒制备功能化磁性细菌纳米纤维素． J. Vis. Exp. (2016)。

本视频展示了通过在含有甘露醇的营养培养基中培养纤维素生成细菌来制备纳米纤维素的方法。细菌将甘露醇代谢为葡萄糖，随后葡萄糖被聚合并挤出形成葡聚糖链，这些葡聚糖链结晶为纤维素片层，并在气–液界面处形成三维基质。所得到的胶状菌膜被收集后，经碱洗和水洗纯化，并通过高压灭菌实现灭菌，以用于后续应用。

方案

1. 细菌纤维素（BNC）的制备

注意： 除非另有说明，所有步骤均需在无菌条件下进行。

1. 配制培养基。
   1. 将25 g酵母提取物、15 g蛋白胨、125.0 g甘露醇与500 ml高纯度水混合，配制500 ml液体培养基。120 °C高压灭菌20 min，4 °C保存。
   2. 通过将15 g琼脂加入5.0 g酵母提取物、3.0 g蛋白胨、25.0 g甘露醇和100 ml高纯度水中，制备100 ml半固体培养基。在120 °C下高压灭菌20 min。灭菌后，将5 ml该混合物倒入90 mm × 16 mm的塑料培养皿中。置于4 °C使溶液凝胶化，并在此温度下储存备用。
2. 复水 Glucoacetobacter xylinus (G. xylinus 按照生产商说明书指示，通过加入1 ml液体培养基并用移液器反复吹打，使冻干小瓶中保存的菌株重悬。
3. 使用接种环将少量细菌悬液以小液滴形式接种于含有半固体培养基的培养皿中。通过从培养皿边缘向中心以“之”字形移动接种环，确保接种物覆盖整个培养皿表面。
4. 将培养皿置于26 °C培养箱中孵育72小时，无需CO2环境。孵育结束后可见微小的白色菌落。若菌落暂不使用，可用Parafilm封口后将培养皿倒置，于4 °C保存。菌落以此方式可保存长达6个月。
5. 将2 ml液体培养基转移至24孔组织培养板的每个孔中。用接种针从已接种的培养皿中挑取两个菌落，放入组织培养板的第一个孔中。对剩余的23个孔重复相同操作。
6. 在30 °C下孵育细胞培养板7天。这将产生总共24个细菌纤维素（BNC）膜片，直径为16 mm，厚度约为2–3 mm，如图所示 图1.注意： 孵育期间切勿干扰细菌培养物，例如不要摇动培养板。在孵育期间， G. xylinus 在静态培养条件下，于气液界面处挤出葡萄糖吡喃糖分子，形成一种聚合的结晶网状结构，其形状和大小与培养瓶一致。这种聚合物基质被称为细菌纳米纤维素（BNC），在培养结束时清晰可见。
7. 从培养基中收集BNC菌膜，并将其置于200 ml含1% NaOH的溶液中，在50 °C下灭菌1小时，以彻底去除所有残留物 G. xylinus可选步骤：使用磁力搅拌子和搅拌板，以300 rpm转速搅拌该溶液。弃去氢氧化钠溶液，加入200 ml新配制的1% NaOH溶液。重复此过程一次，或直至溶液中的BNC菌膜呈现半透明状。
8. 用纯水冲洗BNC薄膜三次，并将其保存在室温的高纯度水中。确保BNC薄膜完全浸没在水中，且在任何时间均不得干燥。
9. 在121 °C下高压灭菌BNC薄膜20分钟。注意：一个 体内 大鼠皮下植入研究由Märtson及其同事开展，结果显示，植入60周后未观察到细菌纤维素（BNC）出现降解迹象。实际上，BNC在自然条件下可被微生物和真菌酶降解，而此类酶在哺乳动物体内并不存在。另一方面，BNC的生物降解性可能源于削弱微原纤维网络的机械、化学和生物过程 体内.

结果

图1. 细菌纤维素的宏观形态。 细菌纤维素（BNC）膜在培养约11天后获得，厚度约为3 mm。培养时间的长短取决于预期用途的具体要求。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Glucoacetobacter xylinus	ATCC	700178
琼脂	Sigma Aldrich	A1296-500G
D-甘露醇 Bioxtra	Sigma Aldrich	M9546-250G
酵母提取物	BD Biosciences	212750
细菌用蛋白胨	Sigma Aldrich	P0556
氢氧化钠，50% 水溶液	Sigma Aldrich	158127-100G