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1. 化学试剂与仪器的准备
1. 配制500 ml的1%六偏磷酸钠（SHMP）(NaPO3)n溶液，并通过高压灭菌进行灭菌。
2. 在密闭的玻璃培养皿中，通过高压灭菌对硝酸纤维素（NC）滤膜（孔径 0.22 µm，直径 47 mm）进行灭菌。
3. 在密闭的玻璃培养皿中，通过高压灭菌对NC滤膜（孔径0.22 µm，直径25 mm）进行灭菌。
4. 称量并记录无菌50 ml离心管（带盖）的空重（每个样品一支管）。
5. 准备 1× Tris-EDTA 缓冲液（TE 缓冲液）：配制含有 10 mM Tris（三（羟甲基）氨基甲烷）和 1 mM EDTA 缓冲液的溶液。调节 pH 至 8，并通过高压灭菌进行灭菌。
6. 通过将 0.02 g 溶菌酶溶解于 1 ml TE 缓冲液中，配制溶菌酶溶液（20 mg/ml）。建议每次使用前新鲜配制。4 °C 保存，不超过 1 周。
7. 通过将 8 g/L 氯化钠（NaCl）溶解于蒸馏水中来制备生理溶液。通过高压灭菌进行灭菌。
2. 从沉积物中分离生物量
1. 使用经乙醇火焰灭菌的金属勺，将 3 g 沉积物样品加入已预先称重的无菌 50 ml 离心管中。操作应在洁净且经紫外线灭菌的生物安全柜中进行，以避免污染。
2. 使用无菌刻度滴定管向样品中加入 15 ml 的 1% 无菌（经高压灭菌）SHMP 溶液。也可通过过滤 SHMP 溶液以避免污染。
3. 使用液体分散器/均质机（例如 Ultra-Turrax 均质机）对沉积物和 SHMP 溶液进行均质处理。使用前用 70% 乙醇灭菌或高压灭菌分散转子。在 17,500 rpm 转速下运行均质 1 分钟。让样品静置 2 分钟，然后以相同转速再次均质 1 分钟。
4. 让样品静置10分钟。在此步骤中，最重的颗粒（矿物质）将沉降。然而，样品中的细胞及任何有机组分仍将保留在溶液中。随后，将上清液（含有细胞生物量）转移至一支洁净的50 ml离心管中，注意不要扰动底部的沉淀物。
5. 向沉淀物中再次加入 15 ml 1% 无菌（经高压灭菌）SHMP 溶液，使用无菌刻度滴定管进行操作。然后重复步骤 2.3 和 2.4。此重复操作可确保最大程度地将细胞和有机颗粒从沉积物的矿物组分中分离出来。第二次分离所得的上清液可与第一次分离的上清液合并。
注意：以下所有步骤均在上清液（含有细胞生物量）中进行。矿物组分（沉淀物）可弃去。
6. 将样品在 20 × g 条件下离心 1 分钟。此步骤的离心力足以使微小的矿物颗粒沉淀，而生物细胞成分仍保留在溶液中。离心后，将上清液（含有细胞生物量）转移至一个新的洁净 50 ml 离心管中。弃去矿物沉淀物。
7. 通过称量样品来确定含有生物量的溶液的最终体积。称重法可避免将样品转移至量筒，从而降低污染风险。
3. 在滤膜上收集生物量
1. 准备一个过滤装置（适用于直径为47 mm的滤膜）和一台真空泵。通过高压灭菌法对过滤装置进行灭菌，或者如果为Pyrex玻璃材质，则用70%乙醇喷洒后用本生灯火焰灼烧灭菌。在继续后续操作前，让装置冷却。
2. 使用经乙醇火焰灭菌的镊子将无菌的 NC 膜添加到过滤装置中。
3. 取上清液样品的一半（来自步骤 2.6）加入膜过滤装置中，使用真空泵将细胞收集在膜上。
4. 当液体完全通过滤膜后，关闭真空泵，并使用经乙醇火焰灭菌的镊子小心地取出滤膜。将滤膜放入无菌培养皿中。
1. 使用经乙醇火焰灭菌的剪刀将膜切成两半。将膜的每一半分别加入到两个独立的 2 ml 离心管中。其中一半膜用于DNA提取及整个细菌群落的分析；另一半滤膜将保存于 -80 °C，作为备份。
5. 将一张新的硝酸纤维素膜置于过滤装置上，并使用真空泵收集样品体积第二部分（来自步骤 2.6）的生物量。
6. 当液体完全通过滤膜后，关闭真空泵，使用经乙醇火焰灭菌的镊子小心取出滤膜。将整张滤膜放入一个独立的 2 ml 离心管中。该样品将用于处理以分离内生孢子与营养细胞。样品可在 -20 °C 保存至使用。
4. 营养细胞的裂解
1. 对先前收集在NC膜上的生物量（步骤 3.6）进行处理，以分离芽孢和营养细胞。
1. 如果膜已冷冻，请在室温下放置10分钟以解冻。然后将膜放入无菌培养皿中，用经乙醇火焰灭菌的剪刀将其剪成较小的碎片（约剪4次）。接着，将所有膜滤片放入一个无菌的2 ml离心管中。
2. 向含有样本膜的离心管中加入 900 µl 的 1× TE（Tris-EDTA）缓冲液（见1.5），并通过涡旋充分混匀。此步骤可将生物量从膜上转移至 TE 缓冲液溶液中。
3. 将离心管置于65 °C、80 rpm的振荡培养箱中孵育10分钟。随后从培养箱中取出离心管，静置冷却15分钟。
4. 加入 100 µl 新鲜配制的溶菌酶（见1.5），使其终浓度达到 2 mg/ml。在样品冷却至 37 °C 之前请勿加入溶菌酶，否则可能导致酶降解。
5. 在 37 °C、80 rpm 条件下孵育样品 60 分钟，此为溶菌酶裂解营养细胞的最佳条件。
6. 裂解完全后，向样品中加入 250 µl 的 3 N 氢氧化钠（NaOH）和 250 µl 的 6% 十二烷基硫酸钠（SDS）溶液。加入后样品体积达到 1.5 ml，NaOH 的终浓度为 0.5 N，SDS 的终浓度为 1%。
7. 将该混合物在室温下以 80 rpm 振荡孵育 60 分钟。加入碱和去垢剂有助于最终的细胞裂解。这些去垢剂的浓度已优化，可在裂解营养细胞的同时不破坏芽孢。
8. 准备一个可容纳直径为25 mm滤膜的无菌过滤装置，通过高压灭菌法进行灭菌，或者（如果是Pyrex玻璃材质）喷洒70%乙醇并用本生灯火焰灼烧。待其冷却。
9. 使用经乙醇火焰灭菌的镊子将一个 0.2 µm 的 NC 膜（直径 25 mm）放置在过滤装置上。
10. 将步骤 4.7 的样品加入膜上，使用真空泵过滤液体。当液体完全通过后，关闭真空泵。在此步骤中，裂解的营养细胞物质被去除，因为其不会被膜保留。只有内生孢子会留在膜上。
11. 加入 2 ml 无菌生理溶液以冲洗残留的洗涤剂，并使用真空泵过滤液体。
12. 当液体完全滤过后，关闭真空泵。将膜保留在过滤装置上。