荧光标记阻遏蛋白介导的复制阻断 大肠杆菌

摘要

来源：Mettrick, K. A., Lawrence, 等，利用荧光阻遏蛋白-操纵子系统在E. coli中诱导位点特异性复制阻滞。J. Vis. Exp. (2016)

本视频展示了利用阿拉伯糖诱导表达黄色荧光蛋白标记的TetR蛋白结合染色体上tetO阵列，从而在Escherichia coli中实现位点特异性的复制叉阻断。

方案

1. 使用荧光阻遏蛋白-操纵序列系统（FROS）阻断复制

1. 诱导复制阻断
   1. 将携带 tetO 阵列和质粒 pKM118 的新鲜过夜培养的 E. coli 菌株用稀释的复合培养基（0.1% 胰蛋白胨、0.05% 酵母提取物、0.1% NaCl、0.17 M KH₂PO₄、0.72 M K₂HPO₄）稀释至 OD₆₀₀nm = 0.01，并根据需要添加抗生素用于筛选。
      注意：不要添加四环素进行筛选，因为它与此系统不兼容。将培养物体积配制为每份样品 10 ml。例如，图 1 中实验设计所需的培养物体积为 60 ml。
   2. 在 30 °C 下振荡培养，直至 OD₆₀₀ nm = 0.05–0.1。取出 10 ml 样品作为未诱导对照组，并向剩余培养物中加入 0.1% 阿拉伯糖以诱导 pKM1 质粒表达 TetR-YFP。继续同时培养未诱导和已诱导的培养物。诱导 1 小时后，使用荧光显微镜检查已诱导培养物中每个细胞是否出现单一焦点信号。
   3. 若确认诱导细胞发生阻断（超过 70% 的细胞具有单一焦点），记录 OD₆₀₀nm 值，并取 7.5 ml 样品用于二维凝胶电泳分析。同时从未诱导对照培养物中取等量样品。

结果

图1：FROS复制阻断与释放实验流程概述。 携带tetO阵列的E. coli菌株在30 °C下培养。当细胞OD₆₀₀nm超过0.05时，用阿拉伯糖（ara；0.1%）诱导TetR-YFP的表达。同时继续培养一部分未诱导的细胞作为30 °C下的对照组。诱导1–2小时后，通过荧光显微镜分析诱导细胞的样品。若确认复...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
胰蛋白胨	Sigma-Aldrich	16922	生长培养基组分
氯化钠	VWR	27810.364	生长培养基组分
酵母提取物	Sigma-Aldrich	92144	生长培养基组分
磷酸二氢钾	Sigma-Aldrich	P9791	生长培养基组分；钾缓冲液组分
磷酸氢二钾	Sigma-Aldrich	P3786	生长培养基组分；钾缓冲液组分
L-阿拉伯糖	Sigma-Aldrich	A3256	用于诱导 TetR-YFP 表达
Axioskop 2 荧光显微镜	Zeiss	452310	细胞观察
eYFP 滤光片组	Chroma Technology	41028	YFP 观察
CCD 相机	Hamamatsu	Orca-AG	细胞观察
MetaMorph 软件（Molecular Devices）	SDR Scientific	31282	本文稿件制备中使用版本为 7.8.0.0