环介导等温扩增技术用于细菌基因检测

摘要

来源： Domesle, K. J., 等环介导等温扩增用于筛查 沙门氏菌 动物饲料中的检测与确认 沙门氏菌 从培养分离。 视频实验杂志. (2020).

本视频演示了环介导等温扩增（LAMP）技术，通过在恒定温度下扩增DNA来检测目标细菌基因。反应体系的制备包括加入等温扩增主混合液、针对目标基因的特异性引物以及含有DNA模板的样品。扩增反应在LAMP仪器中启动，并通过实时荧光监测以确认目标基因的存在。

方案

注意：环介导等温扩增（LAMP）反应体系包含 DNA 聚合酶、缓冲液、硫酸镁（MgSO₄）、dNTPs、甜菜碱、去离子水以及针对靶标序列设计的六条特异性引物。₄)，脱氧核苷三磷酸（dNTPs）、引物、DNA模板和水。前四种试剂包含在一种等温扩增主混合液（isothermal master mix）中材料表）。引物在实验室内部预先混合成引物混合物（10×）。DNA模板可来源于动物源性食品样品增菌液，用于筛查目的，或来源于可疑菌落的培养物 沙门氏菌 用于确认目的的分离物。此外，设置阳性对照（从任意样本中提取的DNA） 沙门氏菌 参考菌株，例如， Salmonella enterica 血清型鼠伤寒沙门氏菌ATCC 19585 [LT2]）和无模板对照（NTC；无菌分子级水）均需在每次LAMP反应中设置。

1. DNA模板的制备

1. 从动物源性食品增菌液中提取DNA模板的步骤如下。
   1. 无菌称取25 g动物饲料样品（如干猫粮、干狗粮、牛饲料、马饲料、禽类饲料和猪饲料）至无菌滤袋中材料表），或等效物。将袋子放入大型容器或支架中，以便在孵育期间提供支撑。
   2. 加入225 mL无菌缓冲蛋白胨水（BPW），通过轻轻旋转和短暂手摩混匀，室温静置60 ± 5分钟。
   3. 轻轻摇动混匀，用试纸测定pH值。如有需要，用无菌1 N氢氧化钠（NaOH）或1 N盐酸（HCl）调节pH至6.8 ± 0.2。在35 ± 2 °C条件下培养24 ± 2 h。
   4. 轻轻旋转装有动物饲料增菌液的袋子，充分混匀。从袋子的滤过侧转移1 mL液体至微量离心管中，短暂涡旋振荡。
   5. 使用样本制备试剂提取 DNA（材料列表如下所示。
      1. 以 900 x g 离心 g 离心1分钟以去除大颗粒，将上清液转移至新的微量离心管中。
      2. 在 16,000 x g 条件下离心 g 2 分钟后弃去上清液。
      3. 将沉淀重悬于100 µL样品制备试剂中，在干式加热块中于100 ± 1 °C加热10分钟。
      4. 冷却至室温，将样本DNA提取物于-20 °C保存。
2. 从疑似样本中制备DNA模板 沙门氏菌 培养物，请遵循以下步骤。
   1. 获得初步结果 沙门氏菌 按照美国食品药品监督管理局《分析方法手册》第5章（BAM Chapter 5）从所有食品的培养分离中获得的分离株， 沙门氏菌 D 部分：分离 沙门氏菌.
   2. 接种疑似 沙门氏菌 在非选择性琼脂平板（如血琼脂、营养琼脂和胰蛋白酶大豆琼脂）上划线分离，并于35 ± 2 °C培养24 ± 2 h。
   3. 将数个单菌落转移至5 mL胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）或脑心浸液肉汤（BHI）中，在35 ± 2 °C条件下培养16 ± 2 h。​
      注意：如果假设的 沙门氏菌 培养物为纯培养时，可通过将数个单菌落悬浮于5 mL TSB中，取500 μL菌液于干式加热块中在100 ± 1 °C加热10分钟，制备DNA模板。随后继续进行下文步骤5。
   4. 将500 µL过夜培养物转移至微量离心管中，在干式加热块中于100 ± 1 °C加热10分钟。
   5. 冷却至室温，将分离的DNA提取物于-20 °C保存。
3. 为制备阳性对照DNA，可参照上述步骤，从疑似样本中制备DNA模板。 沙门氏菌 增加一个稀释步骤的培养物。
   1. 接种 S. 鼠伤寒沙门氏菌 ATCC 19585 (LT2) 或任何 沙门氏菌 在非选择性琼脂平板（如血琼脂、营养琼脂和胰蛋白酶大豆琼脂）上培养参考菌株，并于35 ± 2 °C条件下孵育24 ± 2 h。
   2. 将数个单菌落转移至5 mL TSB或BHI肉汤中，在35 ± 2 °C条件下孵育16 ± 2小时，使其菌液浓度达到约10⁹ CFU/mL
   3. 将过夜培养物在0.1%蛋白胨水中进行系列稀释，以获得约10⁷ CFU/mL
   4. 将500 µL该稀释液转移至微量离心管中，在干式加热块中于100 ± 1 °C加热10分钟。
   5. 冷却至室温，将阳性对照 DNA 置于 -20 °C 保存。

2. 引物混合物（10倍浓度）的制备

1. 获取商业合成的LAMP引物（Sal4-F3、Sal4-B3、Sal4-FIP、Sal4-BIP、Sal4-LF和Sal4-LB），采用标准脱盐纯化方法表1). 通过加入适量无菌分子级水溶解引物，配制每种引物的贮存液（100 µM）。涡旋振荡10秒以充分混匀，于-20 °C保存（长期保存置于-80 °C）。
2. 根据工作表配制引物混合物（10x）表2。将适量体积的引物储备液和无菌分子级水加入微量离心管中。涡旋振荡10秒，充分混匀所有试剂。将10倍浓度的引物混合液分装至每管500 µL，于-20 °C保存。

LAMP 反应的组装

注意：为防止交叉污染，强烈建议将用于配制 LAMP 预混液和添加 DNA 模板的区域在物理上分隔开。图1 为 LAMP 示意图。

1. 准备与运行设置
   1. 使用异丙醇和可降解DNA及DNase的溶液（材料表）清洁实验台。使用可降解DNA及DNase的溶液清洁移液器和管条架（材料表）。
   2. 将等温扩增主混合液、引物混合液（10倍浓度）、分子级水、阳性对照DNA以及DNA模板在室温下解冻。
   3. 打开LAMP仪器（材料表），轻触启动屏幕进入主界面。按照以下步骤创建一次运行。
      注意：一种型号的LAMP仪器具有两个模块（A和B），每个模块可容纳8个样本；另一种型号则为单个模块，共容纳8个样本（材料表）。
      1. 点击LAMP+退火，选择编辑以输入样本信息。
         注意：默认的LAMP运行程序包括在65 °C下扩增30分钟，随后进行从98 °C到80 °C的退火阶段，降温速率为每秒0.05 °C。
      2. 点击每个样本行以激活光标，并输入相应的样本信息，使用AB模块图标在两个LAMP仪器模块之间切换。
      3. 当所有样本信息输入完成后，点击确认图标。
         注意：可选操作是将运行设置（称为“程序”，包含样本信息及默认LAMP运行程序）保存以供后续使用。点击保存图标，并为该程序命名唯一名称。下次测试相同样本集时，可通过已保存的程序快速启动新运行。点击主界面左下角的文件夹图标，选择程序以加载已保存的程序。
2. LAMP反应体系构建
   注意：当同时使用两个LAMP仪器模块（A和B，共16个样本）时，应按18个样本量配制LAMP主混合液；若仅使用一个模块（共8个样本），则按10个样本量配制。对于其他样本数量，应相应调整体积以补偿移液损耗。每次LAMP运行均须包含一个阳性对照和一个无模板对照（NTC）。建议对每个样本在独立的LAMP运行中进行重复检测。
   1. 根据工作表（表3）配制LAMP主混合液。将适量的等温扩增主混合液、引物混合液和分子级水加入微量离心管中，轻轻涡旋混匀3秒，短暂离心。
   2. 将管条放入管条架中，向每孔加入23 µL LAMP主混合液。
   3. 对所有DNA模板进行涡旋振荡并短暂离心。向对应孔中加入2 µL DNA模板，盖紧盖子。
   4. 将管条从架上取下，轻弹手腕，确保所有试剂均聚集于管底。
   5. 将管条装入LAMP仪器模块中，在关闭盖子前确保管盖已牢固密封。

4. LAMP 反应运行

注意：在 LAMP 反应过程中，使用 FAM 通道采集荧光信号。达到荧光比值最大扩增速率时的时间点即为峰值时间（Tmax；min），由仪器自动确定。Tm（°C）是最终扩增产物的熔解/退火温度。

1. 点击屏幕右上角的 运行 图标，并选择包含试管条的区域以启动 LAMP 运行。
2. 可选操作：在反应进行过程中，点击 温度、扩增 和 退火 选项卡，查看 LAMP 运行期间各项参数的动态变化。
3. 运行完成后，点击 扩增 和 退火 选项卡查看完整的扩增曲线和退火曲线，并点击 结果 选项卡查看检测结果。
4. 可选操作：为便于记录，可记录屏幕左上角显示的运行编号，格式为“仪器序列号_运行编号”，例如：“GEN2-2209_0030”。

表1：用于动物饲料中沙门氏菌的筛查及培养分离物中沙门氏菌确认的LAMP引物。引物设计基于沙门氏菌invA基因序列（GenBank登录号M90846）。

引物名称	描述	序列 (5´-3´)	长度 (bp)
Sal4-F3	正向外侧引物	GAACGTGTCGCGGAAGTC	18
Sal4-B3	反向外侧引物	CGGCAATAGCGTCACCTT	18
Sal4-FIP	正向内侧引物	GCGCGGCATCCGCATCAATA-TCTGGATGGTATGCCCGG	38
Sal4-BIP	反向内侧引物	GCGAACGGCGAAGCGTACTG-TCGCACCGTCAAAGGAAC	38
Sal4-LF	环正向引物	TCAAATCGGCATCAATACTCA-TCTG	25
Sal4-LB	环反向引物	AAAGGGAAAGCCAGCTTTACG	21

表2：LAMP引物混合物（10倍浓度）配制工作表。引物序列见表1。

组分	储存浓度 (µM)	引物混合物浓度 (µM)	体积 (µL)
Sal4-F3 引物	100	1	10
Sal4-B3 引物	100	1	10
Sal4-FIP 引物	100	18	180
Sal4-BIP 引物	100	18	180
Sal4-LF 引物	100	10	100
Sal4-LB 引物	100	10	100
分子生物学级水	N/A	N/A	420
总计	N/A	N/A	1000

表3：LAMP反应体系配制工作表。引物混合液（10倍浓度）根据表2，使用表1所列引物的储备液配制而成。

组分	工作浓度	终反应浓度	每样本体积 (µL)	18 个样本总体积 (µL)	10 个样本总体积 (µL)
ISO-001 等温扩增主混合液	1.67x	1x	15	270	150
引物混合液	10x	1x	2.5	45	25
分子级水	N/A	N/A	5.5	99	55
主混合液小计	N/A	N/A	23	414	230
DNA 模板	N/A	N/A	2	N/A	N/A

结果

图1：示意图 沙门氏菌 LAMP 工作流程

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
脑心浸液（BHI）肉汤	BD诊断系统公司，斯帕克斯，马里兰州	299070	用于培养的液体生长培养基 沙门氏菌.
缓冲蛋白胨水（BPW）	BD诊断系统公司，斯帕克斯，马里兰州	218105	用于复苏的预增菌培养基 沙门氏菌 来自动物性食品样品。
DNA AWAY	赛默飞世尔科技，马萨诸塞州沃尔瑟姆	7010	消除实验室台面、玻璃器皿和塑料器皿上的非目标DNA及DNase，且不影响后续DNA样本。
Genie Explorer 软件	英国西萨塞克斯郡，OptiGene有限公司	版本 2.0.6.3	支持远程操作Genie仪器，包括LAMP检测和数据分析。
Genie II 或 Genie III（LAMP 仪器）	英国西萨塞克斯郡 OptiGene 公司	GEN2-02 或 GEN3-02	一种小型仪器，可精确控温至100 °C，控温精度为±0.1 °C，并通过FAM通道同步进行荧光检测。Genie II 包含两个区块（A和B），每个区块可容纳8个样本。Genie III 配备一个单区块，可容纳8个样本。
Genie strip	英国西萨塞克斯郡，OptiGene有限公司	OP-0008	8孔微量管条，带一体式锁紧扣盖，工作体积为10至150 µl。
Genie 条带支架	英国西萨塞克斯郡 OptiGene 公司	GBLOCK	用于在建立LAMP反应时固定Genie试纸条，铝制支架也可用作冷却块。
盐酸（HCl）溶液，1 N	Thermo Fisher Scientific，沃尔瑟姆，马萨诸塞州	SA48-500	在添加BPW后、过夜增菌前，调节动物饲料样本的pH值。
加热块	赛默飞世尔科技，马萨诸塞州沃尔瑟姆	88-860-022	在100 ± 1 °C条件下加热样品以提取DNA。
培养箱	赛默飞世尔科技，马萨诸塞州沃尔瑟姆	3960	标准实验室培养箱
ISO-001 等温扩增预混液	英国西萨塞克斯郡 OptiGene Ltd. 公司	ISO-001	一种优化的预混液，用于简化LAMP反应的配制，含有来自地芽孢杆菌属（Geobacillus spp.）的链置换GspSSD DNA聚合酶大片段、耐热无机焦磷酸酶、反应缓冲液、MgSO₄、dNTPs以及双链DNA结合染料（FAM检测通道）。
异丙醇	赛默飞世尔科技，马萨诸塞州沃尔瑟姆	A416	对工作台面进行消毒。
LAMP 引物	Integrated DNA Technologies 公司，爱荷华州科拉尔维尔	自定义	LAMP 引物，详细信息见表 1。
微型离心机	Eppendorf 北美公司，纽约州霍普奇	22620207	MiniSpin plus 个人微型离心机
微量离心管	Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆	05-408-129	标准微量离心管。
分子生物学级水	Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆	AM9938	用于制备引物储备液、引物混合液和LAMP反应体系。
1 N 氢氧化钠（NaOH）溶液	Thermo Fisher Scientific，沃尔瑟姆，马萨诸塞州	SS266-1	在添加BPW后、过夜增菌前，调节动物饲料样本的pH值。
非选择性琼脂（例如血琼脂、营养琼脂和胰蛋白酶大豆琼脂）	Thermo Fisher Scientific，沃尔瑟姆，马萨诸塞州	R01202	用于培养的固体生长培养基 沙门氏菌.
蛋白胨水	BD诊断系统公司，斯帕克斯，马里兰州	218071	稀释过夜 沙门氏菌 用于制备阳性对照 DNA 的培养物。
移液器和吸头	Mettler-Toledo Rainin LLC，美国加利福尼亚州奥克兰	Pipet Lite LTS 系列	标准实验室移液器及吸头。
PrepMan Ultra 样品制备试剂	Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆	4318930	一种用于快速制备LAMP反应所需DNA模板的简易试剂盒。
沙门氏菌 参考菌株 LT2	ATCC，美国弗吉尼亚州马纳萨斯	700720	沙门氏菌 用作阳性对照的参考菌株。
胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）	BD诊断系统公司，斯帕克斯，马里兰州	211768	用于培养的液体生长培养基 沙门氏菌.
涡旋混合器	Scientific Industries, Inc.，纽约州博伊米亚	SI-0236	标准实验室涡旋混合器。
Whirl-pak 滤膜袋	Nasco 采样品牌，威斯康星州福克斯阿金森	B01318	用于动物饲料样品前增菌的滤袋。