环介导等温扩增技术用于细菌基因检测

摘要

来源： Domesle, K. J., 等环介导等温扩增用于筛查 沙门氏菌 动物饲料中的检测与确认 沙门氏菌 从培养分离。 视频实验杂志. (2020).

本视频演示了环介导等温扩增（LAMP）技术，通过在恒定温度下扩增DNA来检测目标细菌基因。反应体系的制备包括加入等温扩增主混合液、针对目标基因的特异性引物以及含有DNA模板的样品。扩增反应在LAMP仪器中启动，并通过实时荧光监测以确认目标基因的存在。

方案

注意：环介导等温扩增（LAMP）反应体系包含 DNA 聚合酶、缓冲液、硫酸镁（MgSO₄）、dNTPs、甜菜碱、去离子水以及针对靶标序列设计的六条特异性引物。₄)，脱氧核苷三磷酸（dNTPs）、引物、DNA模板和水。前四种试剂包含在一种等温扩增主混合液（isothermal master mix）中材料表）。引物在实验室内部预先混合成引物混合物（10×）。DNA模板可来源于动物源性食品样品增菌液，用于筛查目的，或来源于可疑菌落的培养物 沙门氏菌 用于确认目的的分离物。此外，设置阳性对照（从任意样本中提取的DNA） 沙门氏菌 参考菌株，例如， Salmonella enterica 血清型鼠伤寒沙门氏菌ATCC 19585 [LT2]）和无模板对照（NTC；无菌分子级水）均需在每次LAMP反应中设置。

1. DNA模板的制备

1. 从动物源性食品增菌液中提取DNA模板的步骤如下。
   1. 无菌称取25 g动物饲料样品（如干猫粮、干狗粮、牛饲料、马饲料、禽类饲料和猪饲料）至无菌滤袋中材料表），或等效物。将袋子放入大型容器或支架中，以便在孵育期间提供支撑。
   2. 加入225 mL无菌缓冲蛋白胨水（BPW），通过轻轻旋转和短暂手摩混匀，室温静置60 ± 5分钟。

结果

图1：示意图 沙门氏菌 LAMP 工作流程

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材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
脑心浸液（BHI）肉汤	BD诊断系统公司，斯帕克斯，马里兰州	299070	用于培养的液体生长培养基 沙门氏菌.
缓冲蛋白胨水（BPW）	BD诊断系统公司，斯帕克斯，马里兰州	218105	用于复苏的预增菌培养基 沙门氏菌 来自动物性食品样品。
DNA AWAY	赛默飞世尔科技，马萨诸塞州沃尔瑟姆	7010	消除实验室台面、玻璃器皿和塑料器皿上的非目标DNA及DNase，且不影响后续DNA样本。
Genie Explorer 软件	英国西萨塞克斯郡，OptiGene有限公司	版本 2.0.6.3	支持远程操作Genie仪器，包括LAMP检测和数据分析。
Genie II 或 Genie III（LAMP 仪器）	英国西萨塞克斯郡 OptiGene 公司	GEN2-02 或 GEN3-02	一种小型仪器，可精确控温至100 °C，控温精度为±0.1 °C，并通过FAM通道同步进行荧光检测。Genie II 包含两个区块（A和B），每个区块可容纳8个样本。Genie III 配备一个单区块，可容纳8个样本。
Genie strip	英国西萨塞克斯郡，OptiGene有限公司	OP-0008	8孔微量管条，带一体式锁紧扣盖，工作体积为10至150 µl。
Genie 条带支架	英国西萨塞克斯郡 OptiGene 公司	GBLOCK	用于在建立LAMP反应时固定Genie试纸条，铝制支架也可用作冷却块。
盐酸（HCl）溶液，1 N	Thermo Fisher Scientific，沃尔瑟姆，马萨诸塞州	SA48-500	在添加BPW后、过夜增菌前，调节动物饲料样本的pH值。
加热块	赛默飞世尔科技，马萨诸塞州沃尔瑟姆	88-860-022	在100 ± 1 °C条件下加热样品以提取DNA。
培养箱	赛默飞世尔科技，马萨诸塞州沃尔瑟姆	3960	标准实验室培养箱
ISO-001 等温扩增预混液	英国西萨塞克斯郡 OptiGene Ltd. 公司	ISO-001	一种优化的预混液，用于简化LAMP反应的配制，含有来自地芽孢杆菌属（Geobacillus spp.）的链置换GspSSD DNA聚合酶大片段、耐热无机焦磷酸酶、反应缓冲液、MgSO₄、dNTPs以及双链DNA结合染料（FAM检测通道）。
异丙醇	赛默飞世尔科技，马萨诸塞州沃尔瑟姆	A416	对工作台面进行消毒。
LAMP 引物	Integrated DNA Technologies 公司，爱荷华州科拉尔维尔	自定义	LAMP 引物，详细信息见表 1。
微型离心机	Eppendorf 北美公司，纽约州霍普奇	22620207	MiniSpin plus 个人微型离心机
微量离心管	Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆	05-408-129	标准微量离心管。
分子生物学级水	Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆	AM9938	用于制备引物储备液、引物混合液和LAMP反应体系。
1 N 氢氧化钠（NaOH）溶液	Thermo Fisher Scientific，沃尔瑟姆，马萨诸塞州	SS266-1	在添加BPW后、过夜增菌前，调节动物饲料样本的pH值。
非选择性琼脂（例如血琼脂、营养琼脂和胰蛋白酶大豆琼脂）	Thermo Fisher Scientific，沃尔瑟姆，马萨诸塞州	R01202	用于培养的固体生长培养基 沙门氏菌.
蛋白胨水	BD诊断系统公司，斯帕克斯，马里兰州	218071	稀释过夜 沙门氏菌 用于制备阳性对照 DNA 的培养物。
移液器和吸头	Mettler-Toledo Rainin LLC，美国加利福尼亚州奥克兰	Pipet Lite LTS 系列	标准实验室移液器及吸头。
PrepMan Ultra 样品制备试剂	Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆	4318930	一种用于快速制备LAMP反应所需DNA模板的简易试剂盒。
沙门氏菌 参考菌株 LT2	ATCC，美国弗吉尼亚州马纳萨斯	700720	沙门氏菌 用作阳性对照的参考菌株。
胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）	BD诊断系统公司，斯帕克斯，马里兰州	211768	用于培养的液体生长培养基 沙门氏菌.
涡旋混合器	Scientific Industries, Inc.，纽约州博伊米亚	SI-0236	标准实验室涡旋混合器。
Whirl-pak 滤膜袋	Nasco 采样品牌，威斯康星州福克斯阿金森	B01318	用于动物饲料样品前增菌的滤袋。