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环介导等温扩增用于细菌基因检测

2025年11月28日

本文内容

摘要

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来源：Domesle， K. J. 等人。 环介导等温扩增用于筛选动物饲料中的沙门氏菌并确认培养分离中的沙门氏菌。 J. Vis. Exp.（2020年）。

本视频演示了环介导等温扩增（LAMP）技术，通过在恒定温度下扩增DNA来检测目标细菌基因。反应混合物通过加入等温主混合液、目标基因的特定引物以及含有DNA模板的样本来制备。扩增在LAMP仪器中启动，实时监测荧光以确认目标基因的存在。

方案

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注意：环介导等温扩增（LAMP）反应混合物包含DNA聚合酶、缓冲液、硫酸镁（MgSO4）、脱氧核苷酸三磷酸盐（dNTPs）、引物、DNA模板和水。前四种试剂被包含在等温主混合物中（材料表）。引物会在内部预混成引物混合物（10倍）。DNA模板可以从动物食品样本的富集汤中制备用于筛选，或从推定沙 门氏菌 分离株的培养中制备以进行确认。此外，每次LAMP检测中还包含一个阳性对照（从任何沙 门氏菌 参考菌株提取的DNA，例如沙 门氏菌肠杆 菌Typhimurium ATCC ATCC 19585 [LT2]）和无模板对照（NTC;无菌分子级水）。

1. DNA模板的制备

  1. 要从动物食品富集中制备DNA模板，请遵循以下步骤。
    1. 将25克动物食品样本（如干猫粮、干狗粮、牛饲料、马饲料、家禽饲料和猪饲料）无菌称重，放入无菌滤袋（材料表）或同等物中。将袋子放入大型容器或架子中，以便孵化时提供支撑。
    2. 加入225毫升无菌缓冲肽水（BPW）。通过旋转和短暂的手部按摩来充分混合。放置室温60±5分钟。
    3. 搅拌均匀，用试纸测定pH值。如有需要，将pH值调整为6.8 ± 0.2，使用无菌1N氢氧化钠（NaOH）或1N盐酸（HCl）。在35±2°C下孵育24±2小时。....

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结果

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图1：沙门氏菌LAMP工作流程示意图。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
脑心输液（BHI）汤BD诊断系统，Sparks，MD299070用于沙 门氏菌培养的液体培养基。
缓冲肽水（BPW）BD诊断系统，Sparks，MD218105用于从动物食品样本中回收 沙门氏菌 的预富集培养基。
DNA消失马萨诸塞州沃尔瑟姆，Thermo Fisher Scientific7010消除实验室台、玻璃器和塑料器皿中的不需要的DNA和DNase，同时不影响后续DNA样本。
Genie Explorer 软件英国西萨塞克斯的OptiGene有限公司版本 2.0.6.3支持远程作Genie仪器，包括LAMP运行和数据分析。
Genie II 或 Genie III（LAMP 乐器）英国西萨塞克斯的OptiGene有限公司GEN2-02 或 GEN3-02一台小型仪器，能够控制温度±最高可达100°C，精度为0.1°C，并通过FAM通道同时检测荧光。Genie II有两个方块（A和B），每个方块有8个样本。Genie III有一个可容纳8个样本的单块。
精灵条英国西萨塞克斯的OptiGene有限公司OP-00088孔微管条带内置锁帽，工作容积为10至150微升。
Genie条带架英国西萨塞克斯的OptiGene有限公司G区块铝制支架用于安装LAMP反应时的Genie条，也可以用作冷却块。
盐酸（HCl）溶液，1 N马萨诸塞州沃尔瑟姆，Thermo Fisher ScientificSA48-500添加BPW后且在过夜浓缩前调整动物食品样本的pH值。
加热块马萨诸塞州沃尔瑟姆，Thermo Fisher Scientific88-860-022在100±1°C加热样本以提取DNA。
孵化器马萨诸塞州沃尔瑟姆，Thermo Fisher Scientific3960标准实验室孵化器。
ISO-001 等温母混合比英国西萨塞克斯的OptiGene有限公司ISO-001一种优化的主混合液，简化LAMP反应的组装，包含来自Geobacillus属的GspSSD链置换DNA聚合酶大片段、热稳定无机焦磷酸酶、反应缓冲液、MgSO₄、dNTPs以及双链DNA结合染料（FAM检测通道）。
异丙醇马萨诸塞州沃尔瑟姆，Thermo Fisher ScientificA416消毒工作表面。
LAMP引火综合DNA技术公司，爱荷华州科拉尔维尔习惯LAMP引子，详见表1。
微离心机Eppendorf北美，纽约州豪波格22620207MiniSpin加个人微离心机。
微离心管马萨诸塞州沃尔瑟姆，Thermo Fisher Scientific05-408-129标准的微离心管。
分子级水马萨诸塞州沃尔瑟姆，Thermo Fisher ScientificAM9938用于制造底火托、底火混合物和LAMP反应混合物。
氢氧化钠（NaOH）溶液，1 N马萨诸塞州沃尔瑟姆，Thermo Fisher ScientificSS266-1添加BPW后且在过夜浓缩前调整动物食品样本的pH值。
非选择性琼脂（例如血琼脂、营养琼脂和色替替酪大豆琼脂）马萨诸塞州沃尔瑟姆，Thermo Fisher ScientificR01202用于沙 门氏菌培养的固体培养基。
佩普顿水BD诊断系统，Sparks，MD218071通过一夜稀释沙 门氏菌 培养物，生成正对照DNA。
移液器和吸头梅特勒-托莱多雷宁有限责任公司，加利福尼亚州奥克兰Pipet Lite LTS 系列标准实验室移液器和吸头。
PrepMan Ultra样品制备试剂马萨诸塞州沃尔瑟姆，Thermo Fisher Scientific4318930一种用于快速制备DNA模板以用于LAMP反应的简单试剂盒。
沙门氏菌 参考株LT2ATCC，马纳萨斯，弗吉尼亚州700720沙门氏菌参考菌株作为正对照使用。
色氨酸大豆汤（TSB）BD诊断系统，Sparks，MD211768用于沙 门氏菌培养的液体培养基。
涡旋混合器科学工业公司，纽约州博希米亚SI-0236标准实验室涡旋混合器。
旋转装滤袋NASCO 采样品牌，威斯康星州阿特金森堡B01318用来装动物食品样本进行预丰富的过滤袋。

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标签

LAMP DNA

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