基于电穿孔的荧光生物分子向细菌细胞递送

摘要

来源： Aigrain, L., et al. 通过电穿孔法实现活体微生物中荧光生物分子的内化与观察。 J. Vis. Exp. (2015)

该视频演示了利用电穿孔技术将荧光生物分子导入电感受态微生物细胞的过程。首先，将带有荧光标记的 DNA 或蛋白质加入预冷的细胞悬液中。随后施加高压脉冲，使细胞膜形成瞬时孔隙，从而促进生物分子进入细胞质。经过恢复培养后，细胞通过洗涤和过滤去除未内化或结合在细胞表面的分子。最后，将标记后的细胞置于载玻片上进行荧光成像，以观察细胞内组分。

方案

1. 电穿孔

1. 孵育
   1. 将最多5 µl储存在低盐缓冲液（< 50 mM 盐）中的标记分子加入一份感受态细胞（20 µl 细菌或 50 µl 酵母）中，冰上孵育10分钟。
      注意： 荧光标记分子在储存溶液中的浓度以及电穿孔前加入细胞的标记分子量与加载效率直接相关（图1及讨论部分）。由于某些蛋白质对低盐条件的耐受性较差，可适当提高储存缓冲液中的盐浓度，但此时需相应减少电穿孔前加入细胞的标记分子体积。
   2. 将细胞与标记生物分子的混合物转移至预冷的电穿孔杯中（细菌使用0.1 cm间隙，酵母使用0.2 cm间隙）。轻轻敲击电穿孔杯以去除溶液中可能存在的气泡。
   3. 将电穿孔杯放入电穿孔仪中，并对溶液施加高压电脉冲（0.9 至 1.8 kV/cm，有关电压选择的更多细节参见讨论部分）。该脉冲可在细胞膜上形成瞬时孔隙，使标记的生物分子扩散进入细胞内。
   4. 检查电穿孔仪上显示的时间常数是否在4至6 ms之间。较低的时间常数通常由盐浓度过高和/或电穿孔杯中存在气泡引起，会导致细胞加载效率极低甚至完全失败。
2. 恢复
   1. 电穿孔后立即向细胞中加入500 μl富集培养基，如含分解代谢抑制的超级优化肉汤（SOC）、EZ Rich Defined Medium、酵母提取物蛋白胨葡萄糖培养基（YPD）或任何其他富集培养基。
   2. 将样品在37 °C（细菌）或29 °C（酵母）下孵育2至10分钟。若需进行活力测定（即评估电穿孔后生长和分裂的细胞百分比），建议采用较长的恢复时间（最长可达1小时），因为我们观察到在首次细胞分裂前存在此类延迟期。
3. 洗涤步骤
   1. 通过在3300 x g、4 °C条件下离心1分钟收集细胞，以去除未被内化的生物分子。弃去上清液，并将细胞重悬于500 μl磷酸盐缓冲盐水（PBS）中。
      注意： 对于每个样品，应准备一个阴性对照，即用相同量的标记生物分子孵育但不进行电穿孔处理的细胞，并以与主样品完全相同的方式进行洗涤。
   2. 重复上述步骤3次。
   3. 对于蛋白质内化实验，应根据目标标记蛋白的性质和行为优化洗涤程序。以下步骤为可能的优化示例：
      1. 使用含100 mM NaCl和0.005% Triton X-100的PBS进行前三轮洗涤，以去除可能黏附于细胞外膜的非内化蛋白。
         1. 将电穿孔后的细胞用装在1.5 ml 微离心管内的孔径为0.22 µm的滤膜过滤：将细胞悬液移入滤膜中，800 x g、4 °C离心3分钟，弃去滤过液；向细胞上加入500 µl新鲜PBS，再次按前述条件离心，重复此步骤一次。
      2. 在第一轮洗涤过程中加入少量蛋白酶K（500 μl PBS中加入10 ng），以消化任何未被内化的蛋白质。
   4. 在3300 x g、4 °C条件下离心1分钟收集细胞。弃去上清液，并将细胞重悬于150 μl PBS中。
   5. 移除琼脂糖垫上的上层盖玻片，逐滴加入10 µl细胞悬液并均匀铺展。在垫上覆盖一张未使用过的洁净、灼烧过的盖玻片（No 1.5厚度，匹配显微镜物镜规格），并轻轻按压载玻片。
   6. 将琼脂糖垫置于不透光盒子中避光保存，以保护电穿孔后的细胞在成像不同样品时免受光照影响。

结果

图1：利用光漂白分析技术计数内化分子的数量。 （A） 单细胞光漂白分析。荧光强度随时间变化的轨迹示例（蓝色：原始数据；红色：拟合曲线；插图：WL 和荧光图像） E. coli 在漂白前后的ATTO647N标记的dsDNA负载情况。上图：单步漂白事件。中图：含有 ±3...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
ElectroMax DH5-alpha 电转感受态细胞	Invitrogen	11319-019	或任何其他商用或实验室制备的电转感受态细菌或酵母。
EZ Rich 定义培养基	Teknova	M2105	低荧光富集培养基
MicroPulser 电穿孔仪	Biorad	165-2100	或任何适用于微生物转化的经典电穿孔装置
认证分子生物学级琼脂糖	Biorad	161-3100	用于制备琼脂糖垫的低荧光琼脂糖
显微镜盖玻片，1.5号厚度	Menzel	BB024060SC	通过在500 °C高温炉中加热1小时以去除背景颗粒
单分子荧光显微镜	自制		详见参考文献
定位分析软件	自编，可在线获取		可用于定位分析的MATLAB和C++软件包。
轨迹追踪软件	可在线获取		由Blair和Dufresne开发的MATLAB实现程序。