黏球菌 xanthus 活细胞成像样品的制备

摘要

来源： Schumacher, D., 等荧光活细胞成像技术观察生长缓慢的社会性细菌完整营养细胞周期 黏球菌属黄色黏球菌。J. Vis. Exp. (2018)

本视频演示了黏球菌（Myxococcus xanthus）的制备与成像过程，这是一种生长缓慢的土壤细菌。将培养物在培养基中培养后，接种到载有荧光微球的盖玻片上，并覆盖预热的琼脂糖垫以维持水分和营养供应。该装置可实现对细菌细胞分裂过程中细胞活动的长期、延时活体成像。

方案

1. 显微镜样品的制备

注意：用于显微镜观察的细胞应放置在显微镜盖玻片上，然后覆盖含有营养物质的1%琼脂糖凝胶垫。将盖玻片用胶粘剂固定在塑料或金属支架上，以提供机械支撑。在进行显微镜观察前，应提前按照步骤2.1 - 2.3所述方法制备大块的含1%琼脂糖/TPM/0.2% CTT的凝胶垫。有关此处使用的具体产品，请参见材料表。

1. 准备 500 mL TPM 缓冲液（10 mM Tris-HCl pH 7.6，1 mM KH₂PO₄ pH 7.6，8 mM MgSO₄），并通过高压灭菌或使用瓶顶滤器过滤除菌。

注意： 无菌缓冲液可在室温下保存数月。

2. 准备含0.2% CTT的1%琼脂糖显微镜溶液（将1 g琼脂糖与80 mL TPM缓冲液和20 mL 1% CTT培养基混合）。在微波炉中加热至琼脂糖完全熔化。

注意： 0.2% CTT 足以支持细胞生长并防止饥饿。显微镜观察用培养基中若 CT....

结果

图1：本研究中使用的实验装置示意图。 （A）金属或塑料框架用作样品的支撑。用胶带将盖玻片固定在金属框架上，以减少样品的移动。（B）实验样品装置的侧视图。细胞被固定在（A）所示的盖玻片上。为细胞提供营养和湿度的琼脂.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DMI6000B 配 AFC	Leica microsystems	11888945	带自适应聚焦控制的全自动倒置宽场荧光显微镜
通用安装支架	Leica microsystems	11532338	适用于不同样品尺寸的载物台支架
HCX PL FLUOTAR 100x/1.30 oil PH3	Leica microsystems	11506197	相差物镜
Orca Flash 4.0 相机	Hamamatsu	11532952	400 万像素 sCMOS 相机，用于图像采集
滤光片组 TXR ET, k	Leica microsystems	11504170	荧光滤光片组，激发光：560/40，发射光：645/75
滤光片组 L5 ET, k	Leica microsystems	11504166	荧光滤光片组，激发光：480/40，发射光：527/30
滤光片组 YFP ET, k	Leica microsystems	11504165	荧光滤光片组，激发光：500/20，发射光：535/30
ProScan III	Prior	H117N1, V31XYZEF, PS3J100	带交互式控制中心的显微镜自动化控制器
EL 6000 光源	Leica microsystems	11504115	外置荧光光源
Incubator BLX Black	Pecon	11532830	环绕显微镜的黑色培养室
Tempcontrol 37-2 digital	Leica microsystems	11521719	培养室自动温控系统
庆大霉素硫酸盐	Carl Roth	233.4	庆大霉素
土霉素二水合物	Sigma Aldrich	201-212-8	土霉素
卡那霉素硫酸盐	Carl Roth	T832.3	卡那霉素
Filtropur BT25 0.2 瓶顶滤器	Sarstedt	831,822,101	用于缓冲液灭菌的瓶顶滤器
盖玻片	VWR	630-1592	玻璃盖玻片（60 × 22 mm，厚度：0.7 mm）
Seakem LE 琼脂糖	Lonza	50004	用于显微镜载片的琼脂糖
Leica Metamorph AF	Leica microsystems	11640901	显微镜控制软件及图像分析软件
Tetraspeck 微球，0.5 µm	ThermoFisher	T7281	荧光微球
培养皿	Greiner Bio-one	688102	120 mm × 120 mm × 17 mm 方形培养皿，用于制备琼脂糖垫
BD Bacto Casitone	Becton Dickinson	225930	Casitone
Parafilm M	VWR	291-1213	Parafilm
三（羟甲基）氨基甲烷	Carl Roth	AE15.2	Tris
七水合硫酸镁	Carl Roth	P027.2	硫酸镁
磷酸二氢钾 p.a.	Carl Roth	3904.1	磷酸二氢钾
1% CTT 培养基：1% (w/v) BD Bacto™ casitone，10 mM Tris-HCl pH 8.0，1 mM 磷酸钾缓冲液 pH 7.6，8 mM MgSO₄			用于 M.xanthus 的培养基
TPM 缓冲液：10 mM Tris-HCl pH 8.0，1 mM 磷酸钾缓冲液 pH 7.6，8 mM MgSO₄			用于 M.xanthus 显微镜载片制备的缓冲液