使用微孔板读数仪进行精确且高通量的细菌生长分析

摘要

来源：Kurokawa, M., et al．细菌生长的精确高通量分析．J. Vis. Exp. (2017)

本视频演示了使用微孔板读数仪对细菌生长进行高通量定量的方法。内容涵盖了培养物制备、光密度测定以及生长动态分析等步骤。

方案

1. 实时记录生长情况
   1. 绘制一个96孔板示意图（8 × 12表格），用于标明接种培养样品在96孔板上的位置。打印该表格，并在实验中作为参考。
      注意：由于蒸发作用，微孔板边缘的孔中应仅加入空白培养基。
   2. 在超净工作台上放置一个带盖的灭菌96孔平底微孔板、P-1000移液器、1000-µL移液器吸头、P-200移液器、200-µL移液器吸头、若干1.5-mL微量离心管、8通道移液器、灭菌试剂储液槽、室温M63培养基以及大肠杆菌（Escherichia coli）甘油菌种。
   3. 向试剂储液槽中加入约25 mL M63培养基。此储液用于后续所有步骤。
   4. 向微量离心管中加入900 µL M63培养基，用于制备系列稀释液。
   5. 将甘油菌种在室温下解冻。向解冻后的甘油菌种中加入900 µL M63培养基并涡旋混匀。此操作得到原菌种的10倍稀释液。
   6. 取100 µL上述10倍稀释液，转移至另一含有900 µL M63培养基的微量离心管中，并涡旋混匀。此操作得到100倍稀释液。
   7. 重复步骤1.6，直至达到所需的稀释倍数。
   8. 使用8通道移液器（P-200）向微孔板边缘的孔中各加入200 µL M63培养基。
      注意：这些孔可作为空白对照。
   9. 根据参考表格（步骤1.1），将步骤1.4至1.7制备的各稀释样品各取200 µL加入微孔板相应孔中。加样前需涡旋混匀稀释样品，并将同一样品在板上不同位置的多个孔中重复加入。
   10. 将96孔微孔板放入酶标仪中。
   11. 在“任务管理器”中打开“立即读取”功能，选择相应程序，点击“确定”开始测量。将记录保存为新的实验文件，用于数据分析。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
磷酸氢二钾	Wako	164-04295
磷酸二氢钾	Wako	166-04255
硫酸铵	Wako	019-03435
七水合硫酸镁	Wako	138-00415
盐酸硫胺	Wako	201-00852
葡萄糖	Wako	049-31165
HCl	Wako	080-01066
七水合硫酸亚铁	Wako	094-01082
KOH	Wako	168-21815
甘油	Wako	075-00611
移液器吸头，200 µL	WATSON	110-705Y
移液器吸头，1,000 µL	WATSON	110-8040
微量离心管（1.5 mL）	WATSON	131-715C
8通道移液器	WATSON	NT-8200
Pasorina 搅拌器	AS ONE	2-4990-02
玻璃量筒（200 mL）	AS ONE	1-8562-07
精密pH计	AS ONE	AS800 / 1-054-01
Pipetman P-200	GILSON	1-6855-05
Pipetman P-1000	GILSON	1-6855-06
微量离心管架	BM Bio	801-02Y
涡旋振荡器	BM Bio	BM-V1
Corning Costar 96孔微孔板（平底，透明），带盖	Sigma-Aldrich	Corning, 3370
Corning Costar 试剂储液槽（50 mL）	Sigma-Aldrich	Corning, 4870
EPOCH2	BioTek	2014-EP2-002 / EPOCH2T
BIO 超净工作台	Panasonic	MCV-B131F
细菌菌株	菌种保藏机构；日本国家生物资源项目（NBRP）